狼疮肾炎患者血清及外周血单个核细胞中IL-10和γ干扰素的表达及意义

目的探讨Th1型和Th2型细胞因子在LN发病机制中的作用。方法活动期和非活动期LN患者各30例、健康对照者30例,分别采取外周静脉血,应用逆转录-荧光定量-聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)技术及ELISA方法定量分析LN患者外周血单个核细胞(PBMC)中白介素-10(IL-10)和γ干扰素(IFN-γ)mRNA及血清中IL-10、IFN-γ的自然表达水平。结果活动期和非活动期LN患者血清和PBMC的IL-10水平均显著高于正常对照组,而活动期与非活动期LN患者的IL-10水平比较,差异无显著性。活动期LN患者IFN-γ水平显著高于正常对照组,而非活动期LN患者IFN-γ水平虽有增加趋势,但与正常对照组相比差异无显著性。活动期和非活动期LN患者血清和PBMC的IL-10/IFN-γ的比值与正常对照组比较,差异无显著性。结论LN患者血清和PBMC的IL-10自然表达水平明显增高,但其增高程度与疾病活动度无明显相关;活动期LN患者IFN-γ的表达也显著增高,提示Th1和Th2型细胞因子均可能参与活动期LN的炎症反应及组织损伤。

DNA-PKcs表达与鼻咽癌细胞株放射敏感性的关系

目的探讨不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1(鼻咽高分化鳞癌细胞株)和CNE-2(鼻咽低分化鳞癌细胞株)中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的催化亚基DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞放射敏感性的关系。方法通过克隆形成实验测定CNE-1、CNE-2不同剂量的存活分数,并用线性二次模型拟合剂量存活曲线求出放射生物学参数α、β、SF2、MID值,以及四氮唑蓝比色分析法(MTT法)检测60Co-γ线4Gy照射后12h细胞的存活率,以评价两株细胞的放射敏感性。逆转录实时荧光定量PCR技术(RT-FQ-PCR)检测照射前、后不同时间及不同剂量CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平DNA-PKcs基因的定量表达。结果CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高,MID值分别为2.78、1.61,SF2值分别为0.627、0.341;4Gy照射后12h的存活率分别为88.2%、72.3%;RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有DNA-PKcs基因的表达,其相对表达量之比为7.54±2.71(t=4.17,P=0.014),表达差异有统计学意义,DNA-PKcs基因在CNE-2细胞中存在时间、剂量依赖关系。结论实验验证了CNE-2比CNE-1对射线更敏感,DNA-PKcs基因的表达与鼻咽癌细胞的放射敏感性有关。

育珠对合浦珠母贝N19和Prismalin-14基因表达水平的影响

为探讨育珠对壳基质蛋白基因表达的影响,开展了合浦珠母贝(Pinctada fucata)N19和Prismalin-14基因在育珠贝和非育珠贝中的荧光定量表达研究。结果显示,N19和Prismalin-14在育珠贝与非育珠贝的闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中均无表达,在外套膜均有表达;N19在珍珠囊表达,而Prismalin-14则不表达。N19与Prismalin-14在育珠贝外套膜的表达量均大于非育珠贝,表明育珠可能对某些壳基质蛋白的表达具有一定的促进作用。其中Prismalin-14在育珠贝外套膜的表达量最高(P<0.01),是非育珠贝外套膜Prismalin-14的1.23倍,是育珠贝外套膜N19的25.04倍,是非育珠贝外套膜N19的41.04倍,推测在珍珠贝生长过程中,对Prismalin-14的需求量可能比N19大。N19在育珠贝珍珠囊中表达量最高(P<0.01),是育珠贝N19外套膜的11.58倍,是非育珠贝外套膜的18.97倍,推测在珍珠形成的过程中,对N19的需求量可能比贝壳自身生长对N19的需求量大。

肉鸡心脏热应激损伤和热休克蛋白mRNA转录水平的相关性

通过分光光度计、组织病理学和荧光定量反转录PCR检测技术,研究肉鸡心脏热应激损伤和热休克蛋白mRNA变化的相关性。试验结果显示,热应激过程中肌酸激酶和谷丙转氨酶的活性呈现波动性变化,肌酸激酶的变化更明显;心脏的组织病理学变化主要表现为心肌纤维变性和坏死;热应激过程中HSC70mRNA也呈现波动性变化,而HSP70mRNA水平呈现上升趋势。结果提示,HSC70mRNA与肌酸激酶活性变化呈现一定负相关,HSC70有可能作为心脏热应激损伤的标志物。

荧光定量PCR检测急性白血病患者外周血WT1基因表达及其临床意义

为研究WT1基因表达与临床疗效和预后的关系,探讨其在白血病微小残留病检测中的作用,用荧光定量RT-PCR方法检测55例初发白血病患者外周血及10例正常人外周血的WT1基因表达,跟踪20例急性白血病患者外周血WT1基因表达。结果显示,白血病初治组(40例ANLL、15例ALL)与正常人外周血WT1基因表达有显著差异(P<0.001)。在急性白血病患者中,WT1≤6.8×10-3组生存期长于WT1>6.8×10-3组(P=0.027);白血病患者初发时WT1呈高度表达,完全缓解后,迅速或缓慢下降至少1个对数级,复发时再次增高。跟踪检测20例急性白血病患者外周血WT1基因表达,结果7例复发,5例在临床复发前2-3月WT1的水平明显增高,至少上升0.8个对数级。结论:荧光定量RT-PCR方法检测白血病外周血WT1表达具有简便易行、准确性高、特异性好的特点。与正常人外周血比较,WT1在各类白血病外周血中呈高度表达,且表达水平与预后负相关;对外周血WT1基因表达进行定量分析,可用于微小残留病的监测。

利用实时荧光定量RT-PCR检测鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达

依据鸡A-FABP和H-FABP基因及参照基因GAPDH序列设计引物,以鸡心肌、胸肌和腿肌、肝脏和腹脂总RNA逆转录合成的cDNA为模板,GAPDH基因为参照基因,应用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测如皋黄鸡和安卡红鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达。结果表明:A-FABP、H-FABP基因和参照基因GAPDH基因融解曲线为单峰,无杂峰及二聚体,其扩增效率分别为99.7%、99.8%和100.0%。如皋黄鸡H-FABP基因在心肌、胸肌和腿肌的差异表达量分别是安卡红鸡的0.0860、0.0680倍和0.0580倍(P<0.05)。H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪含量呈显著负相关。如皋黄鸡A-FABP基因在腹脂和肝脏的表达量分别是安卡红鸡的15.9640倍和10.9640倍(P<0.05),而在心肌、胸肌和腿肌的表达量差异不显著。

检测LUNX mRNA表达诊断非小细胞肺癌微转移的可行性及其临床意义

背景与目的微转移的检测对非小细胞肺癌的个体化治疗和指示预后具有重要意义。LUNX为近年新发现的人类肺组织特异性基因。本研究的目的是检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者LUNXmRNA的表达情况,探讨其作为微转移检测分子标志物的可行性。方法选择初治的NSCLC患者62例,以肺部良性疾病10例与健康人10例作为对照组,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)和普通RT-PCR技术,检测肺癌、良性病变肺组织、骨髓和外周血LUNXmRNA的表达。结果肺癌和良性病变肺组织中LUNXmRNA阳性表达率均为100%。肺良性病变组骨髓及外周血标本和健康对照组外周血标本中LUNXmRNA表达皆为阴性。62例NSCLC患者骨髓LUNXmRNA阳性表达率为38.7%(24/62),外周血LUNXmRNA阳性表达率为29.0%(18/62),至少一项阳性表达者占45.2%(28/62);骨髓LUNXmRNA阳性表达率随分期升高且有统计学意义(P=0.02),与病理类型、肿瘤分化程度无明显关系;外周血LUNXmRNA表达与病理分期、病理类型、肿瘤分化程度均无明显关系。NSCLC患者骨髓和外周血LUNXmRNA表达有相关性(P<0.001)。结论LUNXmRNA可作为检测NSCLC患者微转移的特异、敏感的分子标志物,可能有助于早期诊断肺癌转移,从而指导临床分期和治疗。

H-FABP基因在鹿苑鸡和隐性白羽鸡肉质中的差异表达

以鹿苑鸡和隐性白羽鸡为研究对象,选用心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因作为影响鸡肌内脂肪(IMF)的候选基因,利用实时荧光定量逆转录PCR,对12周龄H-FABP基因mRNA进行定量分析,结合IMF含量和屠宰性状测定,分析H-FABP基因表达水平对IMF含量等性状的影响。结果表明:H-FABP和内参基因GAPDH熔解曲线均为单峰,无杂峰及二聚体,定量准确。鹿苑鸡胸肌和腿肌的IMF含量显著高于隐性白羽鸡。H-FABP基因mRNA表达量与IMF含量呈显著的负相关。隐性白羽鸡H-FABP基因mRNA在胸肌和腿肌的IMF的表达量显著高于生长较慢的鹿苑鸡。

大熊猫轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了能对大熊猫轮状病毒的早期感染和隐性感染做出有效诊断,并为病毒定量分析提供技术支持。本研究根据Gen Bank中登录的大熊猫轮状病毒(GPRV)VP4基因序列设计1对引物,建立一种快速准确的检测大熊猫轮状病毒的荧光定量RT-PCR方法,并对引物浓度、退火温度和循环数进行优化,同时建立标准曲线,并将建立的荧光定量方法与常规RT-PCR方法比较。结果显示,本试验建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高出至少100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法具有良好的特异性和较高的重复性。研究结果表明该方法可以对大熊猫轮状病毒进行稳定、可靠的检测,可以满足大熊猫轮状病毒特性研究和感染诊断的需要。

清远麻鸡H-FABP和A-FABP基因mRNA的差异表达研究

【目的】分析心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因mRNA在不同日龄清远麻鸡不同组织中的差异表达量,为进一步阐明H-FABP、A-FABP在鸡IMF含量和腹脂沉积中的作用机制奠定基础。【方法】依据鸡H-FABP和A-FABP基因及参照基因GAPDH序列设计引物,以鸡心肌、胸肌、腿肌、肝脏和腹脂mRNA逆转录合成的cDNA为模版,应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,检测56和120日龄清远麻鸡A-FABP、H-FABP基因mRNA的差异表达量。【结果】H-FABP、A-FABP和GAPDH的基因融解曲线均为单峰,无杂峰及二聚体,定量准确。120 d时清远麻鸡的胸肌和腿肌的肌内脂肪(IMF)含量显著高于56 d;H-FABP基因mRNA 120 d时在心肌、胸肌和腿肌的差异表达量显著高于56 d,且同一日龄时在心肌的差异表达量显著高于胸肌和腿肌(P<0.05)。120 d时清远麻鸡A-FABP基因mRNA在腹脂和肝脏的差异表达量显著高于56 d;同一日龄时,A-FABP基因mRNA在腹脂的差异表达量显著高于肝脏,A-FABP基因在心肌、胸肌和腿肌中不表达。相关分析表明,H-FABP基因mRNA差异表达量与胸肌、腿肌IMF含量分别呈显著和极显著正相关,A-FABP基因mRNA差异表达量与腹脂率呈极显著负相关。【结论】H-FABP基因主要在鸡肌肉组织的肌内脂肪中表达,而且在心肌中高度表达,与IMF含量呈显著或极显著的正相关,其是IMF含量的下调基因;A-FABP基因主要在腹脂与肝脏中表达,且在腹脂中高度表达,与腹脂率呈极显著负相关,是脂肪细胞的上调基因,且为正调控。

饲粮水平对猪IMF含量、脂肪酸合成酶mRNA表达量及血液激素含量的影响

试验选用84头10 kg左右杜洛克×长白×大约克(DLY)三元杂交阉公猪,随机分成2组,组内设6个重复,每个重复7头猪,研究了在NRC(1998)标准(对照组)、荣昌猪(GB 7223-1987)饲养标准(试验组)2种饲粮条件下营养水平对DLY猪生长肥育期背最长肌I MF含量、HSL及FAS mRNA表达量和血液激素含量的影响。结果表明:降低饲粮营养水平可降低35、80及110 kg DLY猪血清胰岛素含量和35及80 kg猪生长激素含量;同时可升高20、50及110 kg DLY猪血清肾上腺素含量和35、50及110 kg DLY猪胰高血糖素含量。各阶段试验组背最长肌肌内脂肪含量均高于对照组,DLY猪50 kg时达到了显著水平;除50 kg组外,其余各阶段试验组背最长肌HSL mRNA及FAS mRNA表达量均高于对照组;降低饲粮营养水平有升高20、35及80 kg DLY猪FAS mRNA/HSL mRNA的趋势。

荧光定量PCR检测外周血中JAR细胞的探讨

目的 建立灵敏可靠的外周血中检出滋养细胞肿瘤细胞的方法，为早期诊断滋养细胞肿瘤的转移奠定实验基础。 方法 在已知数量的ＪＡＲ细胞掺入１０ｍｌ外周血中建立肿瘤细胞血行转移实验模型，荧光定量逆转录－聚合酶链反应（ＦＱ－ＲＴ－ＰＣＲ）定量检测ＪＡＲ细胞的 β－ｈＣＧ—ｍＲＮＡ。结果 ＦＱ-ＲＴ－ＰＣＲ可检测到相当于１个ＪＡＲ细胞表达的 β－ｈＣＧ—ｍＲＮＡ量，但当ＪＡＲ细胞被掺入１０ｍｌ外周血中时，细胞数＞１０２个方可经富集后可检测到。结论 ＦＱ－ＲＴ－ＰＣＲ是一种敏感的检测手 段，有希望成为检测外周血中滋养细胞肿瘤细胞的敏感方法，将有助于滋养细胞肿瘤转移病例的早期诊断与治疗。

中药狼疮方对狼疮样BXSB小鼠脾细胞CD_(134)/CD_(134)L表达的影响

目的:探讨CD134/CD134L共刺激信号在SLE发病机制中的可能作用及狼疮方对其表达的影响。方法:采用狼疮样BXSB小鼠模型,随机分为3组:狼疮方治疗组、泼尼松治疗组、空白模型组,每组6只,疗程10周。另设与BXSB小鼠同基因的正常C57BL/6小鼠6只为正常对照组。分别采集上述各组小鼠外周血和脾组织进行检测。结果:(1)与正常对照组比较,模型组BXSB小鼠的血清IgG和抗ds-DNA抗体水平和脾组织CD4+CD134+、CD8+CD134+、CD19+CD134L+、CD23+CD134L+的百分比及CD134、CD134L的mRNA拷贝数都显著增高(P<0.05或P<0.01)。(2)狼疮方治疗组或泼尼松治疗组的血清IgG、抗ds-DNA抗体水平和脾组织CD4+CD134+、CD8+CD134+、CD19+CD134L+、CD23+CD134L+的百分比及CD134、CD134L的mRNA拷贝数都显著低于模型组(P<0.05或P<0.01),而与正常对照组比较无统计学差异(P均>0.05)。结论:狼疮样BXSB小鼠存在CD134/CD134L的异常表达。狼疮方可减轻狼疮样小鼠高丙种球蛋白血症,减少体内自身抗体产生,对CD134/CD134L存在泼尼松相当的下调作用,抑制T、B细胞的异常活化,有效地治疗SLE。

糖皮质激素受体在类风湿关节炎外周血单个核细胞中表达水平的研究

目的探讨类风湿关节炎(RA)患者外周血单个核细胞中糖皮质激素受体(GR)α、βmRNA的表达水平及其与RA发病机制、活动性的关系。方法从44例RA患者(活动期24例、缓解期20例)、20例健康对照人群外周血单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,并逆转录为cDNA。应用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-FQ-PCR)检测GRα和GRβmRNA的表达水平,并研究其与血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)的相关性。结果RA患者GRα和GRβmRNA的表达水平均明显高于健康对照人群(P﹤0.01);活动期RA患者GRβmRNA表达水平(-3.5442±0.8017)明显高于缓解期RA患者(1.2175±1.5969)(P﹤0.01);活动期RA患者GRαmRNA表达水平(4.2333±2.1775)与缓解期RA患者(4.2985±1.6109)比较无显著性差异(P﹥0.05);RA患者GRβ表达水平与CRP呈正相关(P=0.01),与ESR、RF均无关;RA患者GRα表达水平与CRP、ESR、RF均无关。结论GRα和GRβ的表达异常可能参与了RA的发病;GRβ表达水平与CRP呈明显正相关,提示其可能与RA疾病活动性相关。

鸡MD肾组织肿瘤病变与HSP60表达的相关性研究

研究在鸡马立克氏病毒(MDV)感染及引发肿瘤的发生、发展过程中肾组织的病变、热休克蛋白60(HSP60)mRNA转录、表达水平的动态变化及HSP60组织细胞内定位,探讨其相关性。通过人工感染建立MD肿瘤模型,利用实时荧光定量RT-PCR,结合病理组织学和免疫组织化学等方法,检测试验鸡肾脏的病理变化,HSP60的组织细胞内定位、蛋白表达量及mRNA转录水平的变化。在注射MDV 21d后肾组织出现明显病理变化;HSP60在肿瘤病灶内的瘤细胞及附近间质巨噬细胞的胞质中呈强阳性表达,在瘤灶外肾小管上皮细胞的胞质内有少量表达;HSP60的表达量,攻毒组始终高于对照组,28～86日龄间差异达极显著水平(P<0.01),28日龄时攻毒组HSP60的表达量分别为空白对照组和疫苗对照组的8.608和12.752倍;7～42日龄间,攻毒组HSP60mR-NA转录水平随病程发展呈开口向下的抛物线样变化,前期(7～21d)转录水平处于上升阶段,后逐渐降低,21d时达转录峰值,分别为空白组和疫苗组的1.222和1.179倍,整个周期内攻毒组HSP60mRNA转录水平均高于空白组,14～28日龄间差异极显著(P<0.01)。MDV引发肿瘤发生发展过程中肿瘤病灶及周围组织内HSP60表达水平升高,HSP60mRNA转录水平相应增加;HSP60表达量同其mRNA转录水平的变化趋势基本相符,但并非完全一致的线性关系,两者与肿瘤的发生、发展密切相关,有望作为鸡MD诊断及发病过程的重要判定指标。

猪瘟病毒感染仔猪接种猪瘟疫苗后抗原的跟踪检测

为了解猪瘟病毒感染仔猪免疫猪瘟疫苗后带毒情况,并比较实验室几种猪瘟抗原检测方法的适用性,采用(CSFV)RT-nPCR、猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR(HCLV-FQ-PCR)和CSFV实时荧光定量RT-PCR(CSFV-FQ-PCR)3种检测方法对田间感染CSFV仔猪疫苗免疫前后带毒情况进行定期跟踪检测。结果显示:本实验室建立的CSFV-FQ-PCR灵敏度高于CSFV-RT-nPCR;猪瘟疫苗免疫48 d后,采用HCLV-FQ-PCR方法检测不到血液中的HCLV;猪瘟病毒感染猪免疫疫苗后仍存在持续带毒现象,因此对猪瘟病毒感染猪必须彻底淘汰。

实时荧光定量RT-PCR法对志贺菌外排泵基因emrE的表达分析

测定临床耐多药志贺菌株H24的外排泵emrE基因的表达情况,尝试建立一个快速检测外排泵基因表达的方法。提取多耐药志贺菌株H24的RNA,用实时荧光定量RT-PCR方法验证H24的外排泵emrE基因mRNA表达水平和耐药的相关性。实时荧光定量RT-PCR获得H24的外排泵基因emrE的mRNA相对表达量,emrE基因的相对表达量为内参基因gapA的2万多倍;同一标本重复扩增,emrE和gapA基因相对拷贝数的平均变异系数分别为1.4%和1.3%,提示本方法可准确检测二者的相对拷贝数。由emrE基因的高表达可以推断它与志贺菌的多耐药有正相关性,这个推断结果与以前通过克隆emrE基因的方法得到的结果一致。所建立的emrE基因荧光定量RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR可进一步应用于志贺菌多耐药株其他外排泵的临床诊断和科学研究。

实时荧光定量PCR检测乳腺癌5种多药耐药基因的表达强度

目的 :检测 5种多药耐药基因在乳腺癌细胞株 MCF- 7和 MCF- 7/ADR里的表达强度变化 ,为乳腺癌多药耐药逆转研究提供新的思路。方法 :通过实时荧光定量 PCR技术分别检测乳腺癌敏感细胞株 MCF- 7和耐药细胞株 MCF- 7/ADR里的 mdr1、MRP、L RP、GST- π、TOPO α基因表达强度。结果 :MCF- 7/ADR里的 mdr1、MRP、LRP、GST- π基因表达强度分别比它们在 MCF- 7里的表达强度相对增加了 1 2 5 .39、5 5 .5 3、1 .2 4、3.38倍 ,TOPO α则降低了 0 .43倍 ,其中 mdr1、MRP表达强度的相对增加倍数均显著高于 L RP、GST- π、TOPO α的增加 (或降低 )倍数 ( P<0 .0 0 1 )。结论 :除了 mdr1之外 ,MRP也可能在乳腺癌的多药耐药产生机制里起重要作用。因此

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

根据文献合成1对针对PRRSV毒株ORF6基因高度保守序列的引物，建立用于检测PRRSV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT～PCR诊断方法。提取PRRSV—LC病毒RNA，经所建立的荧光定量RT—PCR方法扩增，可获得特异的扩增曲线，而日本乙型脑炎病毒（JEV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒（PCV）进行同条件检测，结果为阴性；方法可检测到1 TCID50 PRRSV，比琼脂糖凝胶电泳敏感度高10～100倍。结果表明，所建立的PRRSV荧光定量RT—PCR诊断方法特异性好、敏感性高，可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和科学研究。

糖皮质激素受体-α mRNA在健康鼻腔不同区域黏膜中定量表达的研究

目的检测糖皮质激素受体-α(GR-α)mRNA在健康鼻腔下鼻甲、中鼻甲、钩突黏膜中的定量表达,并探讨其在鼻息肉发生发展中的意义。方法采用荧光定量逆转录PCR(FQ-RT-PCR)检测健康鼻腔下鼻甲、中鼻甲、钩突黏膜中GR-αmRNA的定量表达。结果GR-αmRNA表达在鼻腔正常下鼻甲黏膜为(135.4±5.2)×104拷贝/μg,高于中鼻甲、钩突黏膜(115.9±5.5)×104拷贝/μg,(113.4±6.7)×104拷贝/μg,前者与后两组之间有统计学意义(P<0.01)。结论中鼻甲、钩突黏膜中GR-αmRNA低表达,可能是窦口-鼻道复合体区易发生鼻息肉的机制之一。