RT-RCR产物固相杂交-酶联显色方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度

目的应用RT-PCR-EIJSA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法应用固相杂交一酶联显色方法，将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物，与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色，读取光密度值(OD值)，判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度。并与常规细胞培养法(CCID50)比较。结果证明本方法与细胞培养法(CCID50)的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论RT-PCR-EIJSA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。

定量PCR检测体外扩增脐带血造血干细胞HOXB4基因的表达

目的:通过检测HOXB4基因表达,评价体外扩增的脐带血干细胞(CBSC)自我更新的能力。方法:CBSC在含造血细胞因子(TPO+SCF+FL+G鄄CSF)的无血清培养基体外扩增7天和14天,抽提细胞总RNA,采用定量PCR检测HOXB4基因的表达。结果:CBSC体外培养后,细胞总数可以增加近100倍,但HOXB4的表达较扩增前下降。培养7天HOXB4的水平为扩增前的18%,培养14天,HOXB4表达仅为扩增前的3%左右。结论:CBSC体外扩增细胞数量增加的同时,自我更新能力逐渐下降,甚至消失。

电针对大脑中动脉阻塞大鼠一氧化氮合酶mRNA表达的影响

本课题旨在探讨电针对动物急性脑缺血时神经保护作用的可能机制，由于ＮＯ的作用在脑缺血不同阶段及细胞来源而有所不同，因此，观察了电针对脑缺血后各型ＮＯＳｍＲＮＡ表达的影响，结果表明，针刺可能通过抑制脑缺血后ｎＮＯＳｍＲＮＡ。

河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物,以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系p1基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY p1基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。

PTTG、bFGF、VEGF-C在大肠正常黏膜及大肠癌中的表达及意义

目的:探讨垂体肿瘤转化基因(PTTC)、碱性成纤维细胞生长因子(bFCF)、血管内皮生长因子-C(VECF-C)在大肠癌中的表达及以上指标与大肠癌临床病理因素之间的关系。方法:采用RT-PCR技术检测20例大肠正常黏膜、80例大肠癌组织中PTTC mRNA,应用免疫组织化学法检测20例大肠正常黏膜、80例大肠癌组织中PTTC、bFCF、VECF-C蛋白的表达。结果:大肠癌组织中PTTC、bFCF、VECF-C的表达明显高于大肠正常黏膜组织,且与大肠癌浸润深度、淋巴结转移、Duke’s分期呈正相关,PTTC、bFCF、VECF-C在大肠癌中的表达有显著正相关性。结论:PTTC、bFCF、VECF-C在大肠癌发生、发展、侵袭及转移过程中扮演着重要的角色,可作为判断大肠癌转移及预后的预测因素,且三者可能通过相互作用共同促进大肠癌的恶性进展。

大肠癌组织PTTG、VEGF-C表达及其与微淋巴管生成的关系

目的探讨垂体肿瘤转化基因(PTTG)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)在大肠癌发生、发展中的作用。方法采用RT-PCR技术及免疫组织化学法检测20份大肠正常黏膜(正常组)、80份大肠癌组织(大肠癌组)中PTTG mRNA及PTTG蛋白的表达水平;用D2-40标记微淋巴管,采用免疫组化法检测VEGF-C、D2-40表达,计算微淋巴管密度(LMVD)。结果大肠癌组PTTG、VEGF-C表达量及LMVD均明显高于正常组,且与大肠癌浸润深度、淋巴结转移、Duke's分期呈正相关。结论 PTTG与VEGF-C在大肠癌的发生发展中起重要作用,促淋巴管生成为其主要作用机制;PTTG与VEGF-C可作为判断大肠癌转移及预后的预测指标。

小鼠输卵管、子宫和卵巢组织中的TGF-αmRNA活性

采用 RT-PCR技术分别检测了排卵期和怀孕 1～ 5d小鼠输卵管、子宫及卵巢组织中的转化生长因子-α( TGF-α) m RNA活性。结果发现 ,这一期间内小鼠输卵管、子宫及卵巢中均有较强的 TGF-α m RNA表达 ,其中输卵管和卵巢中的表达量变化不大 ,而子宫中的表达量在怀孕 5d时明显减少。这进一步证实外源 (旁分泌 )

RASSF1基因在胃癌中的表达及其临床意义

背景与目的:探讨RAS相关结构家族基因1(RAS association domain family gene 1,RASSF1)在胃腺癌组织细胞中的表达及其临床意义。材料与方法:用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测胃癌BGC-823细胞系、50例胃癌组织及相应癌旁正常组织中RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C mRNA的表达,以及30例胃癌高危人群、可疑胃癌病人胃黏膜活检标本中的RASSF1基因表达情况;用PCR法检测上述50例胃癌组织中的幽门螺杆菌(Hp)感染率。结果:RASSF1A在胃癌组织中的转录表达缺失率为52%(26/50),其表达缺失率与胃癌分化程度、淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05),但与其组织学类型无相关性。RASSF1A在胃癌高危人群及可疑胃癌病人胃黏膜活检标本中的表达缺失率为20%(6/30),胃癌组织中Hp感染率为64%(32/50),RASSF1A的表达缺失与Hp感染组之间无相关性(P>0.05)。RASSF1B在胃癌组织中的转录表达缺失率为22%(11/50),RASSF1C则全部表达,RASSF1B和RASSF1C在胃癌高危人群及可疑胃癌病人胃黏膜活检标本中全部表达,并且两者与胃癌的组织学类型、分化程度、TNM分期均无相关性。结论:RASSF1A在胃癌组织中存在较高的表达缺失,RASSF1A的表达与胃癌的临床分期和病理分级具有相关性,RASSF1A在胃癌高危人群及可疑胃癌患者胃黏膜活检标本中存在表达缺失,因此有望作为胃癌早期检测的标志物,RASSF1A的表达缺失与Hp感染之间无相关性,它们可能是两个独立的致病因素。

人凝血因子ⅦcDNA基因的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定人凝血因子ⅦcDNA基因。方法:采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,从人胎肝总RNA中扩增人凝血因子ⅦcDNA基因,将其克隆入pGEM-T载体,对阳性克隆进行序列测定和分析。结果:经RT-PCR扩增和克隆,获得了人凝血因子ⅦcDNA基因,经序列分析表明,所克隆的基因序列正确。结论:本试验成功克隆了人凝血因子ⅦcDNA基因,为重组人凝血因子Ⅶ的研究奠定了基础。

人红细胞生成素受体胞外区克隆及序列测定

人红细胞生成素受体 (h EPOR)是人红细胞生成素的作用配体 ,其胞外区是 h EPO的作用域 ,它的克隆、表达对两种分子的相互作用机制以及 EPO类似物 (新型造血药物 )的筛选都有十分重要的意义。以人胎肝为材料 ,通过对其总 RNA的提取 ,利用 RT- PCR方法扩增 h EPOR的胞外区基因和跨膜区基因及推导相应的氨基酸残基排列 ,结果与国外文献报道相比较从而检验其正确性。

淀粉样前体蛋白β位分解酶1与β-淀粉样蛋白在糖尿病大鼠脑组织中的表达及行为学相关性

目的观察糖尿病大鼠脑组织淀粉样前体蛋白β位分解酶1(BACE1)、β-淀粉样蛋白(Aβ)的表达,探讨糖尿病糖代谢异常在阿尔茨海默病中的作用机制。方法腹腔注射链脲佐菌素诱发糖尿病大鼠动物模型,随机分为正常组(N组)、假手术组(S组)、4周模型组(M4组)、6周模型组(M6组)、8周模型组(M8组)。穿梭箱实验、Morris水迷宫实验检测大鼠认知行为学改变,免疫组织化学法、免疫印迹法、RT-PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)检测BACE1;ELISA法检测Aβ在糖尿病大鼠脑组织中的表达,用图像分析仪测定吸光度值。结果M组大鼠的电击次数、学习和记忆潜伏期时间显著延长(P<0.01),主动逃避次数显著降低(P<0.01);ELISA法检测Aβ1-40和Aβ1-42显示糖尿病模型鼠脑组织内Aβ1-40水平明显增高,从正常组的(64.13±6.76)pg/mg升至模型组的(86.43±7.03)pg/mg(P<0.001);Aβ1-42也明显升高,从正常组的(67.43±5.12)pg/mg升至(89.45±5.28)pg/mg(P<0.001);糖尿病模型鼠脑组织内BACE1水平显著增高,ELISA法从正常组的(116.46±8.10)pg/mg升至模型组的(158.73±6.24)pg/mg(P<0.001)。免疫印迹法吸光度值从正常组的0.61±0.11升至模型组的1.52±0.16(P<0.001),RT-PCR法吸光度值从正常组的1.62±0.26升至模型组的3.61±0.32(P<0.001),免疫组织化学法吸光度值从正常组的0.81±0.21升至模型组的2.01±0.36(P<0.001)。BACE1和Aβ表达水平与学习和记忆负相关。结论BACE1和Aβ在糖尿病大鼠脑组织表达增高,糖尿病糖代谢异常增强BACE1和Aβ表达,参与了阿尔茨海默病的发病机制。

拟南芥TGG5基因的克隆、表达和酶学特性

芥子酶是广泛存在于十字花科植物中的一类降解硫代葡萄糖苷的酶。当植物受到病虫侵袭时,芥子酶与其底物硫代葡萄糖苷结合,释放有毒的水解产物形成植物重要的化学防御系统。TGG5是新发现的一类芥子酶基因,对其研究将有利于揭示芥子酶防御系统的功能。试验克隆了拟南芥TGG5基因cDNA,构建酵母表达载体,转化毕氏酵母GS115。经甲醇诱导表达和Ni亲和层析,获得纯化的TGG5重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量集中在58kD左右,并有较明显拖尾,呈现典型的糖基化蛋白的特征。进一步探讨了TGG5重组蛋白的酶学特性,结果表明:该芥子酶的Km为1.96mmol/L,Vmax为0.084mmol/(min·mg);酶反应的最适pH为5.5;该芥子酶在37～80℃范围内有较广泛的温度适应性,并具有较好的80℃热稳定性;NaCl对该酶有明显的抑制作用;低浓度抗坏血酸具有激活芥子酶的作用,抗坏血酸终浓度为1.5mmol/L时,酶活力最大。RT-RCR分析,证实了TGG5只在拟南芥根中特异表达,这表明TGG5可能代表了一个芥子酶基因新亚家族。

IL-lβ干预下KGF在人牙龈成纤维细胞中的基因表达研究

目的:研究不同浓度IL-1β干预下KGF在人牙龈成纤维细胞(HGFs)炎症损伤过程中基因表达水平的变化。方法:取原代培养至5～7代的HGFs,以IL-1β梯度浓度干预,采用RT-PCR方法检测KGF在HGFs中的表达情况。结果:在正常的HGFs中KGF呈弱阳性表达,随着IL-1β的浓度由0.1 ng/ml增加到10.0 ng/ml,KGF表达逐渐增高。结论:KGF在IL-1β引发的HGFs炎症过程中可能发挥重要的作用,为了解牙周病的发病机制提供新的资料。

Hcmv-miR-UL112荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速准确检测hcmv-miR-UL112的方法。方法根据miRBase网站中公布的hcmv-miRUL112基因序列,通过设计引物、探针及优化反应条件,建立了一种实时荧光定量PCR方法对hcmv-miR-UL112进行定量检测,并进行敏感度、重复性和特异性实验,同时对PCR产物进行测序验证。结果获得了1条特异性茎环反转录引物,一条特异性PCR正向引物和通用反向引物。PCR最佳反应条件为95℃10min,53℃2min;95℃15s,57℃40s,共40个循环。该方法的批内变异系数CV和批间CV均<5%,相关系数R2均>0.99,扩增效率均>90.0%。结论成功建立了一种敏感度高、特异性强、重复性好并且简便快速的hcmv-miR-UL112荧光定量qRT-PCR检测方法。

TNF-α、IFN-γ诱导人角质形成细胞β防御素的表达

目的:检测TNF-α、IFN-γ诱导HaCaT细胞β-防御素的表达。方法:用TNF-α、IFN-γ、TNF-α加IFN-γ干预HaCaT细胞后,RT-RCR方法检测hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA的表达。结果:TNF-α干预组HaCaT细胞中hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA,IFN-γ干预组HaCaT细胞中hBD-3 mRNA表达增高(P<0.05),干预12 h时的表达量高于干预24 h时的表达量;TNF-α与IFN-γ联合干预HaCaT细胞12 h时,hBD-2 mRNA、hBD-3 mRNA表达量最高。结论:TNF-α能刺激人角质形成细胞产生hBD-2和hRD-3,而IFN-γ仅能诱导产生hBD-3。

甲型H1N1流感患者血液与尿液样本病毒核酸检测与分析

目的探讨和分析甲型H1N1流感患者血液与尿液样本中是否存在传染性病毒颗粒。方法采用复合探针实时荧光RT-RCR方法,对35例确诊患者血、尿标本中的RNA进行检测。结果35例患者中4例(11.43%)血标本阳性,3例(8.57%)尿标本阳性,PCR产物经测序证实为甲型H1N1病毒的基因序列,同时发现此7例患者的最高体温均>39℃,且6例出现蛋白尿,5例合并感染。结论甲型H1N1流感患者血液与尿液样本中有病毒核酸的存在,提示可能存在感染性病毒颗粒,并引起重症化临床表现,在临床诊疗过程中医、护、技均应加强生物安全防护,避免医院感染。

多发性肌炎肌组织中ICAM-1 mRNA的表达

目的 探讨细胞问粘附分子-1(ICAM-1)参与多发性肌炎(PM)的病理机制。方法 采用RTPCR法检测7名多发性肌炎(PM)患者肌组织中ICAM-1 mRNA的表达。结果 PM患者肌肉活检标本ICAM-1 mRNA的表达明显高于正常对照组(P<0.05)。结论ICAM-1在多发性肌炎肌组织中呈现高表达,表明ICAM-1在PM的炎性细胞浸润破坏病变中起重要的介导作用。

血友病B基因治疗临床试验的安全性研究

报道了血友病Ｂ基因治疗临床Ⅰ期试验的安全性研究，包括反转录病毒基因的ＤＮＡ聚合酶链式反应（ＰＣＲ）、反转录ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交以及ｎｅｏ基因和ｌａｃＺ基因的补救分析（ｒｅｓｏｕｅａｓｓａｙ）．从ＤＮＡ水平。ＲＮＡ水平和病毒活体水平对野生型病毒进行了检测，没有检测到反转录病毒，并对兔和人转基因细胞进行形态学观察、染色体核型分析、软琼脂实验、裸鼠接种实验、兔和裸鼠的病理检测及电镜分析以检测恶性细胞的存在与否，同时进行支原体检测、内毒素和过敏原测定，结果均为阴性．建立了有复制能力的野生型反转录病毒（ＲＣＲ）的检测系统，为基因治疗临床试验的安全性提供了保证．

IL-1β干预后人牙周膜成纤维细胞中TRAF6的基因表达研究

目的:研究IL-1β干预后人牙周膜成纤维细胞中TRAF6的基因表达水平的变化,为细胞因子网络调控牙周膜成纤维细胞功能的研究提供新资料。方法:采用原代培养的人牙周膜成纤维细胞,取5～8代细胞以IL-1β梯度浓度干预,采用RT-PCR法检测TRAF6在人牙周膜成纤维细胞中的表达。结果:在正常的人牙周膜成纤维细胞中未见TRAF6基因表达,IL-1β干预后,TRAF6呈阳性表达,并且随着IL-1β干预的浓度增高,其表达水平上调。结论:IL-1β干预后TRAF6在HPLFs中的表达水平的变化提示TRAF6可能是参与牙周膜成纤维细胞功能调控的重要信号分子。