蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

【目的】建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。【方法】选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。【结果】三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10μL-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。【结论】本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。

实时荧光定量PCR技术监测腌制麻竹笋中乳酸乳球菌动态变化

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术定量监测6 g/100 m L盐质量浓度腌制麻竹笋中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的动态变化。经乳酸乳球菌标准菌株基因组DNA提取、标准阳性质粒制备、标准曲线绘制、各时期竹笋腌制发酵液中细菌基因组DNA提取和乳酸乳球菌qRTPCR特异性扩增,对腌制液中乳酸乳球菌进行定量检测。结果表明,在腌制过程中（0-63 d）,随着腌制时间的延长,乳酸乳球菌含量逐渐升高,在腌制14 d时达到最大值（4.63×10^8 copies/μL）,与0 d（2.41×10^2 copies/μL）相比增加了6个数量级,而后浓度缓慢降低,在腌制63 d时浓度为5.02×10^6 copies/μL。qRT-PCR技术为定量监测腌制麻竹笋中微生物的动态变化提供了一条可靠、快速的有效途径。

胃癌研究中实时定量PCR实验内参基因的选择

目的寻找胃癌研究中较为恒定和适宜作为内参基因。方法选取50例术后胃癌组织和癌旁组织,1株胃正常上皮细胞株和6株胃癌细胞株,分别提取组织和细胞总RNA。q RT-PCR(real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)实时定量方法检测内参基因GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)、ACTB(β-actin)、RPⅡ(RNA polymerase subunitⅡ)和18s RNA在上述两组样本中的表达量,对比四种基因表达的变化。选择肿瘤标志物癌胚抗原CEA(carcino-embryonic antigen)作为待测目的基因,分别用上述4种基因作为内参,用相对定量q RT-PCR的方法在上述组织和细胞中检测CEA的表达。使用ge Norm软件分析最优化的内参基因。结果与癌旁组织相比,对应癌组织中GAPDH、ACTB、RPⅡ的表达均发生明显表达上调(P<0.05),上调倍数分别约为(6.49±1.12)、(5.02±0.87)和(3.68±0.78)倍。而18s RNA在两种组织中未发生明显表达变化(P>0.05)。GAPDH、ACTB、RPⅡ和18s RNA在胃正常上皮细胞和胃癌细胞中表达水平未发生明显变化。用GAPDH、ACTB、RPⅡ作为内参基因时,CEA m R N A上升的倍数和比率均明显减小(P<0.05)。用18s RNA作为内参时,CEA在癌组织中表达明显上升,上升倍数为(2.87±0.56)倍,与癌旁组织相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论在各种组织和细胞中没有完全恒定的内参基因。18s RNA可作为q RT-PCR实验检测胃组织基因表达最适宜的内参基因。

新型鹅星状病毒荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种准确快速检测新型鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)的方法,研究以GAstV毒株JS20为模板,根据GAstV的ORF2基因序列设计特异性引物,在构建重组质粒pGEMT-GAstV的基础上,建立了检测GAstV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法。结果显示:阳性对照重组质粒pGEMT-GAstV在1.087×10^(1)~1.087×10^(8)拷贝/μL浓度之间与qRT-PCR的Ct值呈现良好的线性关系;该qRT-PCR对所检测的鸡星状病毒(cASTV)、禽腺病毒(FAdV)、小鹅瘟病毒(GPV)以及鸭坦布苏病毒(DTMUV)均无交叉反应;检测灵敏度为1.087×10^(1)拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于1.6%。利用该q RT-PCR方法对在鹅胚及LMH细胞上繁殖不同代次的JS20病毒载量进行检测发现,JS20在鹅胚上的扩增效率更高,病毒载量可达10^(8)~10^(9)拷贝/mL。对江苏不同地区26份临床样品进行检测发现,该q RT-PCR方法的阳性检出率为73.08%,而普通PCR方法阳性检出率仅为42.30%。结果表明建立的新型GAstV qRT-PCR具有很好的特异性及灵敏度,且在新型GAstV定量分析及临床样品检测诊断中展示了良好的应用前景。

滇牡丹种子实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析滇牡丹(Paeonia delavayi)不同发育时期的种子中内参基因的表达稳定性,筛选出滇牡丹种子成熟过程中最稳定的内参基因。利用实时荧光定量PCR技术,分析8个传统内参基因GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1在滇牡丹种子不同发育时期的表达差异情况,利用3个分析软件GeNorm、Norm Finder和BestKeeper分别评价上述内参基因在滇牡丹不同发育阶段的种子中的表达稳定性。荧光定量及软件分析结果显示,8个内参基因的稳定性各异,表达最为稳定的内参基因是CYC和EF2α,表达最不稳定的内参基因是ACT。对滇牡丹油脂代谢合成途径中部分相关基因进行RT-qPCR分析,得到了相同的表达趋势,验证了CYC和EF2α适合作为内参基因。得到了两个最适用于滇牡丹种子的内参基因CYC和EF2α。

二斑叶螨多重抗性品系最优内参基因的筛选及CYP392A亚家族基因的表达分析

【目的】筛选出二斑叶螨Tetranychus urticae Koch抗甲氰菊酯、阿维菌素及螺螨酯混剂的实时定量PCR最优内参基因。【方法】选取5.8S rRNA,α-tubulin,TBP,β-actin,ELFn,RPL13a,GAPDH和SDHA 8个候选内参基因,以Ge Norm,Best Keeper和Normfinder 3个软件分析这8个基因在二斑叶螨多重抗性品系中的表达稳定性,并以筛选的内参基因分析二斑叶螨P450酶系CYP392A亚家族基因的表达水平。【结果】经Ge Norm,Best Keeper和Normfinder 3个软件综合评价确定ELFn基因为二斑叶螨敏感品系(susceptible strain,SS)和多重抗性品系(multipesticide resistant strain,Mp-R)各发育阶段的最优内参基因。以ELFn为内参基因对二斑叶螨CYP392A亚家族16个基因表达量进行分析,结果表明:经多重抗性选育40代后,Mp-R品系卵期CYP392A1表达量显著上调;CYP392A16基因在各发育阶段表达量极显著高于SS品系相应发育阶段;其他基因表达量在敏感品系和抗性品系之间差异不显著。【结论】筛选出了SS和Mp-R品系中各发育阶段最佳内参基因为EFLn;Mp-R品系CYP392A亚家族16个基因的表达量在幼螨和若螨阶段低于卵与成螨阶段,其中CYP392A16基因在二斑叶螨多重抗性的形成中起主要作用。该结果为二斑叶螨多重抗性研究奠定了一定基础。

二斑叶螨多重抗性品系解毒酶基因表达模式解析

【目的】二斑叶螨(Tetranychus urticae)是一种重要的农业害螨,由于个体小、繁殖快等特点,极易产生抗药性,论文从生理生化和分子水平探讨二斑叶螨m RNA水平相对表达量的变化,旨在明确二斑叶螨对混剂的多重抗性机制,为该螨的综合治理提供依据。【方法】在温度(25±l)℃,相对湿度60%±5%,光周期L﹕D=16 h﹕8 h的室内条件下,于盆栽豇豆苗上饲养不接触任何药剂的二斑叶螨敏感品系(SS)和用螺螨酯、甲氰菊酯、阿维菌素以其单剂的致死中浓度(LC50)为汰选浓度混合连续汰选的多重抗性品系(Mp-R);Mp-R品系用药4—5次待其种群扩增后,参照FAO推荐的叶片残毒法进行室内毒力测定一次,计算其LC50,求出抗性倍数(RR),并记为一个汰选周期;连续汰选3个周期后,逐渐增加汰选浓度,用Polo Plus软件求其毒力回归方程、LC50、抗性指数及卡方值;采用生化分析法测定选育50代的二斑叶螨SS与Mp-R品系卵、幼螨、若螨、雄成螨、雌成螨的谷胱甘肽S转移酶(GSTs)、羧酸酯酶(Car Es)、多功能氧化酶(MFOs)的活性,以ELFn为内参基因,采用RT-q PCR技术以比较Ct值的方法计算二斑叶螨Mp-R品系中10个与抗性相关的解毒酶基因的表达量。【结果】在室内经50代抗性选育,二斑叶螨对阿维菌素、甲氰菊酯及螺螨酯的LC50分别达到1 103.55、5 993.33和2 345.62 mg?L-1,抗性倍数分别为603.03、167.65和51.77倍。卵中Mp-R品系MFOs比活力显著高于SS品系,GSTs、Car Es比活力差异不显著;其他发育阶段Mp-R品系的GSTs、Car Es比活力显著高于SS品系,MFOs比活力则差异不显著;Mp-R品系雌成螨的GSTs、Car Es比活力显著高于其他发育阶段,卵的MFOs比活力显著高于其他发育阶段。与敏感品系相比,二斑叶螨Tu GSTd05、Tu GSTd06与Tu GSTd09基因表达量在Mp-R品系各发育阶段显著上调1.80倍以上,Tu GSTd01表达量在若螨期显著上调1.63倍,其他发育阶段差异不显著;CYP392E10表达量在卵中极显著上调5.87倍,幼螨、若螨阶段显著上调2.15倍和2.09倍,成螨阶段表达量差异不显著;CYP392A6在卵、幼螨与若螨阶段表达量均显著上调1.89、1.64和1.59倍,在成螨阶段表达量差异不显著。CYP392A16在各发育阶段均极显著上调,卵中上调6.97倍,幼螨中上调8.20倍,若螨中上调8.88倍,雄成螨上调7.34倍,雌成螨上调8.59倍。CYP392D 8在卵、幼螨和雄、雌成螨中表达量均显著上调2.18、2.00、2.03和2.41倍,在若螨阶段表达量差异不显著;Tu CCE35在若螨及雄、雌成螨中表达量显著上调1.58、1.86和2.65倍;Tu CCE36在卵和雄、雌成螨中表达量显著上调1.73、1.89和2.14倍。【结论】与敏感品系相比,二斑叶螨Mp-R品系10个与抗性相关的解毒酶基因表达量在其不同发育阶段均有不同程度的变化。CYP392A16表达量在各发育阶段上调较大,可能参与了二斑叶螨多重抗性的形成;其余基因表达量均未见大幅度上调,这些基因是否参与了对3种药剂的代谢还需进一步验证。

星状病毒核酸检测标准物质的研制

目的：研制用于食品中星状病毒核酸检测的c RNA标准物质。方法：利用基因克隆体外转录方法制备星状病毒c RNA纯品,初步定量后稀释至适宜浓度进行分装,其中一部分分装样品添加RNAsafe处理,剩余部分不做处理,制备2种标准物质样品。采用实时荧光定量实时聚合酶链式反应（real-time-polymerase chain reaction,RTPCR）方法检验2种标准物质样品均匀性和稳定性。样品中RNA浓度（拷贝/μL）通过荧光定量RT-PCR和数字PCR联合定值获得,并进行不确定度分析。结果：均匀性结果显示2种样品组间精密度与组内精密度差异均无统计学意义（P〉0.05）。稳定性检验表明20-25℃10 d、4℃14 d、-20℃3个月及-80℃和液氮6个月2种样品c RNA含量无显著变化。RNAsafe（-）标准物质定值为：（1.652±0.143）×10^8拷贝/μL（-80℃）和（1.652±0.135）×10-8拷贝/μL（液氮）。结论：RNAsafe（-）标准物质样品可作为用于星状病毒核酸检测的标准物质。

应用基因芯片分析红蚰麦白粉菌胁迫条件下的基因表达谱

小麦农家品种红蚰麦携带1对显性抗白粉病新基因,暂命名为Pmhym。为了深入了解该品种抗病的分子机制,用豫麦13/红蚰麦的F3代纯合抗病株系构建抗池,采用Affymetrix小麦基因芯片技术,以白粉菌接种0h为对照,分析白粉菌接种后24h的基因表达谱。在61127基因微矩阵点中,有效差异表达Ratio值≥2或≤0.5的基因共5282个,其中上调基因2553个,下调2729个。对上调序列的分类表明,功能明确的序列中39.81%与抗病/防御相关;下调表达基因中以能量代谢和抗病/防御相关基因比例最高,分别占26.71%和19.65%。上调表达在8倍以上的序列中81个的功能已知,其中包括病程相关基因、防卫反应基因、生成或清除活性氧的基因,以及抗病信号转导基因等。选取上调和下调表达8倍以上的共13个探针序列进行实时定量PCR验证,表明基因芯片数据具有良好的重复性。

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析

为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因的表达模式和功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T_0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。

青鳉鱼ERRα的克隆、序列分析、组织表达及其对不同EDCs暴露的响应

内分泌干扰物质（EDCs）可以通过多种通道影响鱼类的生长、发育和繁殖,而雌激素相关受体（ERR）是一类目前没有引起足够重视的潜在致毒信号通道.本研究克隆了青鳉鱼（Oryzias latipes）ERRαmRNA全序列,并通过实时定量RT-PCR方法对其在不同组织中的表达和不同EDCs暴露下的响应进行了分析.发现青鳉鱼ERRα与其它脊椎动物ERRα氨基酸序列有较高的同源性,特别是DNA结合结构域（DBD）在从鱼类到哺乳类动物的进化过程中高度保守,配体结合结构域（LBD）序列与哺乳动物的LBD有66.4%-67.0%的序列相同.青鳉鱼ERRα与青鳉鱼雌激素受体ERα、ERβ和雄激素受体ARα、ARβ的DBD氨基酸数相同,且有较高序列相似性,但LBD的长度和序列差异较大.青鳉鱼ERRα基因有5个外显子组成,位于第14号染色体.青鳉鱼ERRα基因在各组织中广泛表达,其中在性腺、脑、脾脏、眼和肠中表达较高,且在雌雄性腺中差异表达,表明其在雌雄性别分化和性腺发育中发挥调控作用.暴露200 ng/L炔雌醇（EE2）、200 ng/L雌酮（E1）、200 ng/L己烯雌酚（DES）、100μg/L阿特拉津（AT）和200 ng/L雌二醇（E2）后,青鳉鱼精巢中ERRαmRNA水平分别显著下降至对照组的0.54、0.56、0.61、0.63和0.65倍（p〈0.05）,但暴露1μg/L三丁基锡和1μg/L三苯基锡后上升至对照组的1.34和1.35倍（p〉0.05）,表明ERRα可能参与外源EDCs影响鱼类性别分化和性腺发育的过程.此外,在青鳉鱼ERRα基因上游没有发现类似哺乳动物ERRα基因上游的类固醇激素反应元件半位点,说明鱼类ERRα基因的调控模式与哺乳类存在差异.

松墨天牛肌钙蛋白T基因全长cDNA克隆及分析

采用c DNA末端快速扩增(RACE)方法获得了松墨天牛(Monochamus alternatus)肌钙蛋白T基因c DNA,全长1531bp,命名为Ma Tn T(Gen Bank:KJ756400).该基因开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,等电点为9.26,推测的编码蛋白质分子质量为37.29 ku.同源比对结果表明:Ma Tn T与褐飞虱(Nilaparvata lugens)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)等12种昆虫肌钙蛋白氨基酸同源性为87%-88%;构建的系统发育树显示Ma Tn T处于独立分支;Ma Tn T没有信号肽和跨膜螺旋,属于亲水性氨基酸,二级结构包含了螺旋和不规则卷曲两种形式,含有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)磷酸化位点数分别为8、9、3个.RT-q PCR检测表明,Ma Tn T基因在幼虫、蛹和成虫中均有表达;在成虫触角和足中表达量最高.

基于双基因分析的结肠癌标志基因选择

针对结肠癌标志基因选择问题,引入一种最高得分对(TSP)方法,处理一组包含40个肿瘤和22个正常样本的结肠癌微阵列数据,得到标志基因对(VIP,DARS)并构建双基因分类器。结果显示,该分类器对62例样本的分类准确率可达93.55%。进一步,利用荧光实时定量PCR在10个独立样本上检验所选基因对的分类效果,正确率为100%,表明该方法能有效地选择结肠癌标志基因,对临床诊断有积极的意义。

结直肠癌中miR-31的表达及预测靶基因的生物信息学分析

目的检测micro RNA-31(mi R-31)在结直肠癌中的表达及功能,预测其靶基因并进行生物信息学分析,为研究其作用和调控机制奠定基础。方法采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(q RT-PCR)检测8种结肠癌细胞株、40例结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者癌组织及匹配的正常黏膜组织及33例结直肠腺瘤组织中mi R-31的表达情况,并分析癌组织中mi R-31表达与患者临床特征的关系。MTS法观察转染mi R-31模拟物(mimics)组、抑制剂(inhibitor)组和对照组(mi RControl)及空白细胞组细胞生长的差异,Western blot检测空白细胞组、mi R-31 mimics和inhibitor三组细胞PCNA蛋白的表达。Target Scan、DIANA-micro T、mi Randa等软件预测mi R-31的靶基因,并进行KEGG功能和信号通路富集分析。结果 mi R-31在8种结肠癌细胞株中高表达,同时CRC患者癌组织中的表达高于腺瘤及正常黏膜组织(P<0.05)。其中癌组织和匹配的正常黏膜相比,mi R-31表达明显上调(P=0.035),但腺瘤和正常黏膜相比,差异无统计学意义(t=0.122,P=0.904)。mi R-31的表达与临床病理特征间未见明显关系(P均>0.05)。转染mi R-31 mimics后,mi R-31的表达明显上调且和mi R-Control组及空白细胞组相比,mi R-31 mimics组细胞生长加快;而转染mi R-31 inhibitor组mi R-31表达显著降低,细胞生长活力明显受抑制。同时转染mi R-31 inhibitor组PCNA蛋白表达较mi R-31 mimics组和空白细胞组显著降低。生物信息学分析mi R-31靶基因功能集中于转录后及翻译水平的调节、细胞连接、迁移及细胞运动等生物学过程。信号通路主要富集于内吞作用、轴突导向、T细胞受体信号通路、Wnt及MAPK信号通路。结论 mi R-31在结直肠癌中高表达,且mi R-31可以促进细胞生长和增殖,其靶基因可能通过调节多种生物学过程发挥作用。

幽门螺杆菌对AGS细胞蛋白激酶C同工酶表达的影响

目的研究PKC同工酶在H.pylori感染引起胃癌发生中起作用。方法将幽门螺杆菌和人胃上皮腺癌细胞系AGS细胞共培养(细菌∶细胞=200∶1),在幽门螺杆菌攻击AGS细胞后的0h、0.5h、1h、4h、6h、12h、24h时间点分别提取AGS细胞的总RNA,同时提取相对应时间点平行培养的未受幽门螺杆菌攻击的AGS细胞的总RNA作为对照组,以Beta-actin为内参照,应用Taq-Man实时荧光定量RT-PCR技术研究这些样品的PKC同工酶的mRNA变化情况。结果与对照组相比,PKCε、PKCγ、PKCι、PKCζ、PKCα mRNA水平呈现增高趋势;PKCθ mRNA水平呈现持续下降趋势;PKCδ mRNA水平与对照组呈现一致表达趋势。结论H.pylori可能通过上调具有肿瘤增殖活性的PKCα、ε、γ、ι、ζ,下调了具有凋亡活性的PKCθ,参与H.pylori引起胃癌的发生过程。H.pylori对PKCδ mRNA水平没有影响。

基于RT-qPCR选择性检测水中活性病原菌

以大肠杆菌和粪肠球菌作为研究对象,研究建立了一种逆转录定量PCR(reverse transcription q quantitative PCR,RT-qPCR)方法,以选择性检测水中活性病原菌.研究结果表明,细菌体内的RNA经过RT-PCR逆转录成cDNA后利用qPCR可定量目的基因拷贝数,对处于稳定生长期的大肠杆菌(培养6～18 h)和粪肠球菌(培养10～38 h)体内的RNA含量进行检测分别为1 copies.CFU-1和7.98×102copies.CFU-1,以此作为细菌定量的依据,达到准确定量检测水体中目的基因RNA拷贝数而确定活性细菌含量的目的.通过3种方法(培养法、qPCR、RT-qPCR)检测热灭活后的大肠杆菌和粪肠球菌,结果表明与qPCR相比,RT-qPCR能够区分1.43 lg copy(大肠杆菌)与2.5 lg copy(粪肠球菌)的非活性菌,进而选择性检测活性病原菌.实际水样底物基质对RT-qPCR方法的影响不大,RT-qPCR与培养法之间有较好的线性相关性(大肠杆菌,R2=0.930,粪肠球菌,R2=0.948),本研究建立的方法可以用于实际水样活性病原菌的检测.

松墨天牛肌球蛋白轻链2基因的鉴定及表达模式

为阐明松墨天牛肌肉收缩机理和相关基因表达模式,用构建c DNA文库方法,从松墨天牛c DNA中克隆到松墨天牛肌球蛋白轻链2基因,命名为Ma MLC-2（Gen Bank：KM371003）。该基因c DNA为882 bp,其中开放阅读框（ORF）为618 bp,编码205个氨基酸,推测的蛋白等电点为4.66,分子量为22.26 k Da。Ma MLC-2的氨基酸序列与赤拟谷盗同源性最高,为96%,与东方蝼蛄等8种昆虫同源性为85%-88%。松墨天牛与赤拟谷盗处在系统发育树的同一分支上。Ma MLC-2属于亲水性氨基酸,存在2个EF-hand结构域,长度均为29个氨基酸,其中第1个EF-hand结构域含有Ca2＋结合位点。SWISS-MODEL预测结果显示,Ma MLC-2有2个螺旋-环-螺旋结构。用RT-q PCR分析了Ma MLC-2基因的相对表达量,结果显示：蛹和幼虫的表达量高于成虫;成虫中足表达量最高,腹部表达量最低,各部位均有表达,且有显著差异（P〈0.05）。

千年笛鲷早期发育及视蛋白基因表达规律分析

初步观察千年笛鲷早期发育各个时期的形态特征,同时使用实时荧光定量PCR方法对4种视蛋白基因在早期发育中的表达规律进行分析。研究观察到千年笛鲷卵为圆球形,属浮性卵,中心有一明显的油球。在水温(24.5±0.5)℃的条件下,千年笛鲷胚胎发育共经历6个发育阶段18个时期,从受精卵到孵化一共经历24h。仔鱼经历12—15d发育为稚鱼,30d—35d发育为幼鱼。同时对7个胚胎发育时期和2个仔鱼发育时期4种视蛋白(LWS、SWS1、SWS2、RH)基因的表达情况进行检测,在下包1/2、胚孔封闭、视囊这3个时期有显著性表达(P<0.05),尤其在胚孔封闭时期,表达量达到最高。其余时期4种基因的表达水平显著下降,但在2个仔鱼时期表达量比孵化期略有增加。结果表明千年笛鲷4种视蛋白基因在早期表达过程中与神经胚的形成有密切的联系。

原发性胆汁性肝硬化中增殖诱导配体表达增高及其临床意义

目的探讨增殖诱导配体(APRIL)mRNA在原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(RT-Q-PCR),以18S rRNA为内参,以靶基因与内参基因Ct之差△Ct作为相对定量,来检测42例PBC患者和42例正常体检的外周血单个核细胞(PBMCs)的APRIL mRNA的表达水平,同时检测生化指标ALB,TBIL和免疫指标IgA,IgG,IgM,探讨PBC患者中APRIL基因的表达水平及与上述临床实验室指标的相关性。结果与正常对照组相比,PBC患者PBMCs APRIL mRNA明显升高(P<0.05),且与TBIL与IgM水平呈显著正相关(P<0.05)。结论APRIL mRNA的表达在PBC患者PBMCs显著升高,可作为PBC的辅助诊断和病情监测指标之一。

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期（P〈0.05）,在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达（P〈0.05）,在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高（P〈0.05）,在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。