定量PCR检测联合G试验及GM试验对侵袭性真菌感染早期诊断的价值

目的探讨荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测联合G试验及GM试验对侵袭性真菌感染早期诊断的价值。方法纳入2014年4月—2015年10月我院(宁夏医科大学总医院)ICU、呼吸科及烧伤科等侵袭性真菌感染高发科室中60例IFI高危患者,对60例患者进行血、痰及肺泡灌洗液组织样本真菌培养,并进行血浆(1,3)-β-D葡聚糖检测(G试验)、半乳甘露聚糖抗原检测(GM试验)以及荧光定量RTFQ-PCR检测,观察3种检测方法及联合检测的准确性、灵敏度及特异性,并进行ROC曲线分析,评价荧光定量RTFQ-PCR对IFI的诊断价值。结果G试验IFI确诊组、临床诊断组、拟诊组及排除组检出阳性率分别为100%、70.37%、75.00%和54.55%;GM试验IFI确诊组、临床诊断组、拟诊组及排除组检出阳性率分别为66.67%、70.37%、62.50%和45.45%;RTFQ-PCR检测IFI确诊组、临床诊断组、拟诊组及排除组检出阳性率分别为100%、81.48%、87.50%和22.73%;G试验敏感度为81.58%,特异性59.09%,阳性预测值77.50%,阴性预测值65.00%,符合度为73.33%;GM试验敏感度为76.32%,特异性68.18%,阳性预测值80.56%,阴性预测值62.50%,符合度为73.33%;RTFQ-PCR检测敏感度为84.21%,特异性77.27%,阳性预测值86.49%,阴性预测值73.91%,符合度为73.91%;RTFQ-PCR+G+GM联合检测敏感度为55.26%,特异性95.45%,阳性预测值95.45%,阴性预测值55.26%,符合度为70.00%。结论G试验、GM试验、RTFQ-PCR检测在IFI诊断中均具有较高的临床应用价值(P均<0.05),但G试验、GM试验在IFI诊断中假阳性率较高,故在单种方式检测中推荐RTFQ-PCR检测,而RTFQ-PCR+G+GM联合检测则能够明显提高IFI临床诊断准确性。

新疆杏品种SFB基因的克隆及实时定量表达

以新疆杏27个品种花粉为材料,进行转录水平SFB基因的克隆与测序;选取冬杏、苏陆克、库尔勒托拥3个杏品种,对其进行花粉离体培养,分析SFB基因在不同时期的表达特性。结果表明,在27个品种中扩增出4种大小不同的条带,引物组合1在26个品种中扩增出条带,其中品种贝新纳尔,赛买提的片段大小为447 bp;大优佳的片段大小为446 bp,其余品种的大小为434 bp。引物组合2在品种托乎提中扩增出大小为660 bp大小的条带。序列比对显示27个品种的SFB基因为20种基因序列,与其他物种SFB基因序列比对显示20种基因序列均为新SFB基因序列,在GenBank上的登录号为:HQ148064-HQ148083;SFB基因在3个杏品种花粉离体培养不同培养时期均有表达,其表达丰度的变化趋势一致,呈先增后减的趋势,均在培养24 h时表达丰度最高,但是每个品种的表达峰值不同。

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞体内移植后hBMP-2的活性检测

目的探究人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,h BMP-2)基因植入兔股骨头坏死模型体内后的活性,为后续实验奠定理论基础。方法 1.采用髓芯减压联合液氮冰冻法制备兔股骨头坏死模型;2.将造模成功的兔子随机分为A、B、C3组(n=12),A组不植入材料,为对照组,B、C组分别植入DBM/BMSCs、h BMP-2/BMSCs/DBM;3.术后第1、第2、第3周各组分别处死4只兔子,分别运用PCR、RTFQ-PCR、Western Blot检测股骨头内h BMP-2基因和蛋白的表达量,评估h BMP-2基因在兔体内的活性。结果植入后,在第1、第2、第3周,PCR结果示:A、B两组h BMP-2基因呈阴性表达,C组h BMP-2基因呈阳性表达;RTFQ-PCR示:C组相对表达量分别为1,0.947±0.025,0.895±0.059,P=0.081;Western blot示:A、B两组h BMP-2蛋白在兔体内呈阴性表达,C组h BMP-2蛋白呈阳性表达;凝胶成像系统分析显示:C组h BMP-2蛋白表达灰度值(目的/内参)分别为:0.530±0.056、0.507±0.066、0.475±0.086,且两两之间比较P>0.05。结论 h BMP-2基因转染BMSCs植入兔股骨头坏死模型体内后能够稳定表达,进而能够持续诱导BMSCs向骨细胞分化,达到修复股骨头坏死的目的。

磁珠分离纯化技术在实时荧光定量PCR检测HBVDNA中的应用

目的评价磁珠分离纯化技术（简称磁珠法）提取核酸的重复性、提取效率一致性、线性范围、灵敏度及抗干扰性，初步探讨其在实时荧光定量PCR检测HBVDNA中的应用价值。方法采用磁珠法提取HBVDNAlog值分别为4。16，5．23和7．04的质控血清进行重复性试验，HBVDNA阳性血清10倍梯度稀释的系列标本评价其提取效率一致性，HBVDNA强阳性血清作10倍系列稀释后检测其线性范围，HBVDNA标准血清与舍干扰成分（溶血、黄痘和脂血）的HBVDNA阴性血清，按4：0，3：1，2：2，1：3和0：4比例分别混合成5个不同浓度标本用于千扰试验。以提取方法为沉淀煮沸法的PCR荧光诊断试剂作对照，应用磁珠法及配套扩增试剂检测288份乙型肝炎患者血清HBVDNA含量，并比较测定结果。结果磁珠法批内和批间平均变异系数分别为3．66％和4．75％；HBVDNA含量不同的血清提取效率均在98％以上；在1．28×10^2 IU／L～1．28×10^9IU／L之阍有良好的线性关系；最低检出限为60．5IU／L；不同浓度的黄疸和脂血对扩增曲线和实验结果无明显影响；血清中血红蛋白浓度至50g／L时，HBVDNA结果相差约0．5～1．0个数量级。磁珠法和沉淀煮沸法的阳性率分别为88．19％和82．64％。当沉淀煮沸法检测结果log值处在2．699～4．000之间时，两法检测相应标本结果差异有统计学意义。结论磁珠法高效、快速和易于自动化，应用于HBVDNA检测对乙型肝炎患者的临床诊断和疗效监测将有十分重要的意义。

实时荧光定量PCR检测RAGE mRNA方法的建立及初步应用

目的建立实时荧光定量PCR（RTFQ-PCR）检测人晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA的方法并研究其在食管癌组织中的表达。方法根据Genebank提供的序列在RAGE基因外显子5和6之间设计引物，应用SYBR GreenⅠ荧光染料，建立检测RAGE mRNA的RTFQ-PCR方法，并对其线性、特异性、灵敏度及重复性进行评价；根据标准曲线计算出食管癌及配对远端正常组织中RAGE mRNA含量，并以RAGE mRNA和18SrRNA含量的比值作为评价RAGE mRNA表达水平指标。结果线性范围为5．0×10^3～5．0×10^9copies／ml，相关系数为-0．98，批内变异系数（CV）为0．63％～8．71％，批间CV为1．52％～12．38％。食管癌及配对远端正常组织RAGE mRNA与18SrRNA浓度的对数比值（^-x±s）分别为0．638±0．068和0．334±0．329（P〈0．005），提示食管癌组织RAGE表达上调。结论RTFQ-PCR检测RAGE mRNA的方法具有灵敏、特异、重复性好等优点，RAGE mRNA表达水平与食管癌存在一定相关性。

苹果根皮苷-2-O-糖基转移酶基因克隆与表达模式分析

目的:根皮苷-2-O-糖基转移酶(phloridzin 2’-O-glycosyltransferase,P2’-GT)是根皮苷合成最后一步关键酶,可以把根皮素转化成根皮苷,本研究在富士苹果中克隆出P2’-GT基因,对基因编码产物进行生物信息学分析和基因的表达模式分析。方法:以苹果皮为材料,提取RNA反转录合成cDNA为模板,设计特异性引物进行扩增和测序,利用Pro Param tool、TMHMM等在线软件对编码蛋白进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(realtime?uorescence quatitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)分析P2’-GT在苹果不同部位、不同苹果品种和不同生长时期的表达差异。结果:P2’-GT cDNA全长1 452 bp,编码483个氨基酸,相对分子质量53.6 kDa,等电点5.76,该基因编码蛋白是不稳定蛋白,不具有明显的跨膜结构,二级结构主要有α-螺旋、无规卷曲和延伸链组成,三级结构结果显示P2’-GT蛋白模型与对苯二酚葡萄糖基转移酶相似度最高(41.32%),进化分析表明P2’-GT与白梨糖基转移酶同源性最高。RTFQ-PCR分析发现P2’-GT在3种苹果皮中均高效表达,在叶和根中微量表达,在果肉中不表达;P2’-GT的转录表达受苹果发育调控,在生长初期几乎不表达,随着苹果发育表达量逐渐增加,在生长中期达到最高值,随后开始减少,至苹果成熟期下降到最高值的50%水平。此外,P2’-GT在3种苹果品种中表达不同,在澳洲青苹中表达量最高,在嘎啦中表达量最低。结论:本研究明确了P2’-GT的生物信息学特性及P2’-GT基因在不同生长期和不同部位的表达差异,为调控根皮苷合成的研究提供理论依据。

在肾细胞癌中Survivin高表达及相关性分析

目的研究存活素(Survivin)在肾细胞癌(RCC)发生、发展中的作用和意义,分析其表达与RCC生物学行为(临床分期、病理分级及淋巴转移)之间的关系,为RCC诊断、治疗和判断预后提供依据。方法在2010年3月至2011年9月中南大学湘雅三医院泌尿外科收治的RCC患者中随机挑选出63例,将其手术切除的RCC标本作为研究组,另取其相应的远离肿瘤组织的正常肾组织作为对照组。应用荧光定量PCR法检测2组组织中Survivin mRNA的表达情况,并将该实验结果与RCC的临床分期、病理分级和淋巴结转移等进行相关性分析。结果 63例研究组RCC组织中,Survivin mRNA表达阳性51例(80.95%),对照组正常组织中未发现Survivin mRNA阳性表达,2组Survivin mRNA阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.01)。Survivin mRNA在28例Ⅰ、Ⅱ期RCC中阳性表达16例(57.14%),在35例Ⅲ、Ⅳ期RCC中阳性表达30例(85.71%)。二者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。Survivin mRNA在低、中分化RCC中阳性表达率[85.71%(18/21)、83.33%(10/12)]均明显高于高分化RCC[60.00%(18/30)],差异均有统计学意义(P<0.05)。Survivin mRNA在有淋巴结转移的RCC中阳性表达率[85.71%(30/35)]明显高于无淋巴结转移的RCC[53.57%(15/28)],差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Survivin mRNA在RCC中表达明显高于正常肾组织,而在正常肾组织中不表达。Survivin mRNA的表达可能与RCC的临床分期、病理分级、淋巴转移相关。Survivin有望成为判断RCC转移和预后等生物学行为的重要指标,将有可能成为肿瘤治疗的新靶点。

胰岛素样生长因子结合蛋白7表达质粒的构建及其瞬时转染对SMMC7721肝癌细胞增殖的影响

目的采用TA克隆的方法构建IGFBP7表达载体,考察IGFBP7过表达对SMMC7721细胞生存活力的影响。方法 RT-PCR法调取IGFBP7表达基因,构建p MD19-T-Simple-IGFBP7载体,测序鉴定后与p IRES2-Zs Green1质粒进行拼接构建表达质粒;随后表达质粒转染SMMC7721细胞,RTFQ-PCR测定SMMC7721细胞中IGFBP7 m RNA水平,MTT检测IGFBP7表达质粒转染对SMMC7721细胞增殖的影响。结果 IGFBP7-c-DNA设计长度为840 bp,电泳结果可在750~1 000 bp观察到清晰单一条带,表明成功调取IGFBP7基因;pMD19-TS-IGFBP7载体和p-IRES2-Zs-Green1-IGFBP7表达质粒测序结果正确,表明表达质粒构建成功;RTFQ-PCR结果显示IGFBP7转染组细胞IGFBP7 m RNA水平显著升高;MTT结果显示IGFBP7转染组细胞增殖明显下降。结论成功用TA克隆的方法构建了IGFBP7表达载体,IGFBP7的过表达能显著抑制SMMC7721细胞增殖。

阿勒泰部分地区放牧马梨形虫病的流行病学调查

为了解阿勒泰部分地区放牧马梨形虫病的流行情况,笔者运用前期所建立的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法结合传统血涂片镜检方法,对吐尔洪乡、克孜勒希勒克牧场及铁买克乡等3个地区的134匹放牧马进行了马梨形虫病的流行病学调查;经FQ-PCR检测得出,以上3个地区的感染率分别为36.96%,45.76%和31.03%,以克孜勒希勒克牧场最为严重;3个地区均以感染驽巴贝斯虫为主;根据年龄段分析,幼驹的感染率高于成年马匹。应用SPSS软件分析得知,不同地区和不同年龄阶段的马匹感染梨形虫病差异不显著(P>0.05)。结果表明,阿勒泰地区是马梨形虫病的流行地区。

黄芩甙对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞Toll样受体2、3、4、7 mRNA表达的影响

旨在探讨黄芩甙对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞Toll样受体2、3、4、7 mRNA表达的影响。新城疫病毒(NDV)感染鸡胚成纤维细胞,使用MTT法检测黄芩甙对鸡胚成纤维细胞的最大安全浓度,使用荧光定量PCR方法检测不同浓度黄芩甙对染毒细胞Toll样受体2、3、4、7 mRNA在不同时间表达的影响。结果表明,黄芩甙组和病毒对照组细胞TLR2、TLR4和TLR7 mRNA的表达水平起初受到抑制,TLR2和TLR4 mRNA在24 h内呈上升趋势,TLR7 mRNA在16 h内呈上升趋势,TLR3 mRNA的表达水平呈波动性变化。黄芩甙在24 h时能够促进NDV感染细胞TLR2和TLR4 mRNA的表达,且呈剂量依赖性,从而发挥免疫调节作用,具有抗NDV的功能。

实验室2种检测小儿巨细胞病毒方法的比较

比较胶体金法和实时定量PCR法对小儿巨细胞病毒IgM抗体水平检测的敏感性及准确率。收集临床上243例小儿的血液标本,分别采用实时荧光定量PCR法和胶体金法检测这243例患者外周血巨细胞病毒IgM抗体水平,并对这2种检测方法的阳性率和敏感性进行比较分析。实时荧光定量PCR法阳性率为11.93%,胶体金法为6.58%,2者差异有统计学意义(P<0.01)。在HCMV-DNA检测阳性患者中,IgM抗体阳性组HCMV-DNA拷贝数显著高于阴性组(P<0.01),比较这2种检测方法的敏感性,实时荧光定量PCR法的敏感性为72.5%,胶体金法的敏感性为40%,两者差距有统计学意义(P<0.01)。实时荧光定量PCR法与胶体金法相比,对巨细胞病毒IgM抗体检测具有较高的敏感性和准确率,值得临床推广应用。

宫颈癌组织中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白的表达及临床意义

目的探讨宫颈癌组织中磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(PEBP4)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA和蛋白的表达水平及其临床意义。方法应用实时荧光定量PCR法及免疫组化En Vision法分别检测48例宫颈癌组织和48例正常宫颈组织中PEBP4和mTOR mRNA和蛋白的表达差异,分析其表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系。采用Spearman等级相关分析宫颈癌组织中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表达的相关性。结果宫颈癌组织中PEBP4和mTOR mRNA表达水平均明显高于正常宫颈组织,差异均有统计学意义(均P<0.01)。宫颈癌组织中PEBP4和mTOR蛋白表达的阳性率分别为72.92%和66.67%,均明显高于正常宫颈组织的10.42%和8.32%,差异均有统计学意义(均P<0.01)。PEBP4 mRNA表达水平和蛋白表达阳性率与宫颈癌浸润肌层、淋巴结是否转移和临床分期均有关(均P<0.05)。mTOR mRNA表达水平和蛋白表达阳性率与宫颈癌淋巴结是否转移和临床分期均有关(均P<0.05)。宫颈癌组织中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白之间的表达均呈正相关(均P<0.01)。结论宫颈癌组织中PEBP4和mTOR mRNA和蛋白的表达均明显升高,且两者mRNA和蛋白之间的表达均呈正相关,表明PEBP4和mTOR异常表达可能在宫颈癌的发生、发展中起正向调控作用。

ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响

烟草类胡萝卜素对烟叶品质和可用性有重要作用,ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)是调控类胡萝卜素合成积累的关键酶之一。为研究ZDS基因干扰表达对烟草类胡萝卜素生物合成的影响,从贵州省烟草科学研究院福泉试验基地取样品,采用不同株系相同部位的方式取样,与贵烟1号(GY1)对照,筛选出能够构建RNA干扰(RNAi)载体并成功转化的转基因植株,建立ZDS基因的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR的检测方法,检测新鲜烟叶中ZDS基因表达水平并分析其遗传表型的变化。结果表明,ZDS和其他类胡萝卜素合成关键酶基因的表达均下调,其遗传后代出现异于正常植株的白化与矮化的表型。证明了ZDS基因对产生这种异同发挥了作用,也充分佐证了RNAi技术在基因功能分析中有着重要的作用,但这些样品表现出白化和矮化的表型是否是由于烟草类胡萝卜素的合成受到抑制尚不确定,还需要进一步验证。

藏药郎庆阿塔对肝纤维化大鼠胶原代谢的影响

目的:观察藏药郎庆阿塔对肝纤维化大鼠胶原代谢的影响。方法:采用复合因素(皮下注射40%CCl4/橄榄油溶液+高脂低蛋白复合饲料喂养+给予5%乙醇饮水)构建大鼠肝纤维化模型,造模6周后,于第7周开始分组给药,设置正常对照组、模型组、阳性药组[复方鳖甲软肝片(0.55 g.kg-1]、郎庆阿塔高、中、低剂量组(按生药量计为11.4,5.7,2.85 g.kg-1),分别ig给药7周。实验末期,取肝组织,HE染色观察肝脏组织的病理学变化,Masson染色观察肝组织内纤维化程度,免疫组化法检测肝组织中金属蛋白酶组织抑制因子I(TIMP-I)的表达水平,荧光定量PCR(RTFQ PCR)法测定药物对肝纤维化大鼠肝组织中I型胶原蛋白(CoL-I)mRNA表达的影响。结果:郎庆阿塔高、中剂量对肝纤维化大鼠肝纤维组织增生、肝组织炎症活动度均有显著的改善作用(P<0.05),免疫组化结果表明,郎庆阿塔能明显降低肝纤维化大鼠肝组织中TIMP-I的表达水平(P<0.01),高剂量组阳性率(4.80±0.92)与模型组(8.60±1.52)相比显著下降;此外,郎庆阿塔还能剂量依赖性地降低CoL-I mRNA表达水平,其中高剂量组与模型组相比较有显著性差异(P<0.01)。结论:郎庆阿塔能明显改善肝纤维组织增生,降低肝组织中TIMP-I和CoL-I mRNA的表达,发挥其抗肝纤维化作用。

白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测及抗真菌药物敏感性分析

目的:建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应方法,快速定量检定临床标本中的白色念珠菌并进行抗真菌药物敏感性分析。方法:针对白色念珠菌内转录间隔区和26S核糖体核糖核酸基因设计特异性引物和探针,构建含有上述基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,评价其特异性、灵敏度、重复性和稳定性。对1 185份临床标本中的白色念珠菌进行检测,同时进行真菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。对所有真菌分离株进行抗真菌药物敏感性试验。结果:研究结果显示,建立的白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法专属性强,能准确检出白色念珠菌,而与其他念珠菌属真菌、非念珠菌属真菌、细菌、寄生虫和病毒均无交叉反应,特异性为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测白色念珠菌DNA线性范围达11个数量级,白色念珠菌最低检测限度为5个菌落形成单位。该方法重复性非常好,组内和组间相对标准偏差均小于2%。测试中相关系数、斜率和效率没有显著变化,表明该方法稳定性好,精密度高。将其成功应用于临床标本中白色念珠菌载量的定量检测,用普通PCR和基因克隆测序分析进行了确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作定量分析快速诊断方法。应用TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应从1 185份临床标本中检出94份白色念珠菌阳性标本,真菌培养获得8株存活的白色念珠菌,抗真菌药物敏感性试验分析结果显示:这些白色念珠菌分离株对制霉菌素、咪康唑、克霉唑、益康唑、氟康唑、沃尔康唑均敏感,但对两性霉素B、酮康唑、特比萘芬、氟胞嘧啶已经产生了耐药性。结论:本研究新开发评价的TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应,可以快速简易,精准稳定,特异灵敏地定量检定白色念珠菌,适用于动物源性产品中白色念珠菌检测、食品药品生物制品医疗器械安全检查、环境监测、流行病学调查。

猴真菌监测分析

目的:了解猴真菌携带情况,为猴致病性真菌感染防控提供科学依据。方法:用真菌培养、Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR、普通PCR、基因克隆和测序技术,进行猴的真菌监测分析。对所有真菌分离株进行抗真菌药敏试验。结果:从全国几个不同厂家122只猴中分离获得71株真菌,形态和分子鉴定确证这些真菌为阿萨希毛孢子菌、圆形毛孢子菌、白色念珠菌、黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、焦曲霉、杂色曲霉、聚多曲霉、匿名曲霉、产黄青霉、草酸青霉、变幻青霉、宛氏拟青霉、小刺青霉、绳状青霉、卷枝毛霉、多变根毛霉、伞枝犁头霉、球毛壳霉、热带头梗霉、节菱孢霉菌、暗孢节菱孢菌、链格孢、松色二孢菌。结果表明,猴真菌种类比较丰富,获得真菌11属25种,毛孢子菌属、曲霉属、青霉属、毛霉属、念珠菌属真菌在这些致病真菌中占主导地位。抗真菌药敏试验分析结果显示:这些真菌分离株对制霉菌素、两性霉素B、氟康唑、咪康唑、酮康唑、氟胞嘧啶、特比萘芬已产生了耐药性。结论:联合使用真菌培养、Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR、普通PCR、基因克隆和测序技术能有效分析猴真菌。猴的真菌大多为人兽共患病病原体。研究结果为我国猴真菌监测提供参考数据,为致病性真菌的侵袭防治提供科学依据。

实时荧光定量PCR在念珠菌研究中的应用

念珠菌作为院内感染的常见机会性致病菌,实时荧光定量PCR技术已应用于念珠菌临床快速诊断、基因分型、耐药等研究。实时荧光定量PCR技术以灵敏、快速、安全、准确、高通量等特性,不仅在分子生物学领域作为常规的分析检测方法,而且在医院临床标本病原体的检测、遗传性疾病的诊断、检疫、法医学标本的鉴定等领域也逐步得到了广泛运用。