Connective Tissue Growth Factor Expression in Rabbit Corneal Fibroblast and Its Effect on Fibroblast Proliferation In Vitro

The connective tissue growth factor (CTGF) expression in cultured corneal fibroblasts and its effect on corneal fibroblasts proliferation in vitro were examined. Total RNA was extracted from early passaged rabbit corneal fibroblasts by guanidine isothiocyanate one-step method and mRNA was reversely transcripted into complementary DNA (cDNA). Specific CTGF primers were used in the PCR reaction and the products were analyzed by electrophoresis to determine the expression of mRNA for CTGF against DNA marker. House-keeping gene GAPDH was used as control. Different concentrations of CTGF (0.5, 5, 50, 500, 5 000, 50 000 ng/ml) were added into the third passaged corneal fibroblast culture system, and its effect on corneal fibroblast proliferation was measured by MTT method. The results showed that compared with a GAPDH 450 bp band, CTGF RT-PCR product showed a specific 120 bp band as expected. CTGF produced a dose-dependent increase in the proliferation of corneal fibroblasts but it inhibited fibroblast proliferation at higher concentrations (5 000 and 50 000 ng/ml). It was concluded that proliferating corneal fibroblasts produce CTGF and CTGF helps to promote corneal fibroblast proliferation. The results indicated that CTGF might be involved in the corneal wound healing after photorefractive keratectomy in which corneal fibroblasts are activated to proliferate and secrete growth factors that in turn promote corneal fibroblast proliferation.

自体黄韧带干预下兔硬膜外纤维瘢痕的形成

背景:临床已证实,腰椎术后纤维瘢痕与硬膜或神经根粘连是造成术后疼痛及麻木等症状的重要因素。目的:验证自体黄韧带抑制腰椎术后硬膜外纤维瘢痕形成及探究可能的分子生物学机制。方法:选择6-8月龄的日本大白兔48只,利用随机数字表将兔分为3组:黄韧带保留组、黄韧带不保留组、自体脂肪回置组(脂肪组)。3组兔均建立腰椎椎板切除术模型,于造模后3,6周收集兔硬膜外组织,采用苏木精-伊红染色观察组织变化及成纤维细胞数量密度,VG染色观察胶原纤维面积百分比,免疫组化观察转化生长因子β1、Smad3蛋白的表达。结果与结论:①苏木精-伊红染色结果:黄韧带保留组成纤维细胞较少且排列疏松,黄韧带不保留组和脂肪组成纤维细胞数量较多且排列紧密,术后3,6周黄韧带保留组成纤维细胞数量密度小于黄韧带不保留组和脂肪组(P<0.05),而黄韧带不保留组和脂肪组之间比较并未有明显差异;②VG染色结果:黄韧带保留组胶原纤维稀疏且分布不均,而黄韧带不保留组与脂肪组可见大量红色胶原纤维聚集;术后3,6周黄韧带保留组胶原纤维面积百分比小于黄韧带不保留组和脂肪组(P<0.05),而黄韧带不保留组与脂肪组之间无明显差异;③免疫组化结果:黄韧带保留组蛋白阳性着色程度明显弱于其余两组;术后3,6周黄韧带保留组转化生长因子β1、Smad3吸光度值显著低于其余两组(P<0.05),而黄韧带不保留组和脂肪组之间无显著差异;④结果说明,腰椎手术后均会存在不同程度的硬膜外纤维瘢痕的形成。若在术中保留自体黄韧带,可有利于减少硬膜外成纤维细胞数量以及胶原纤维的形成,从而减轻纤维瘢痕组织与硬膜囊、神经根的粘连,其机制不仅为单纯的机械阻隔作用,同时也可通过干预转化生长因子β1/Smad3信号通路来减少硬膜外纤维瘢痕的形成。

盐酸青藤碱诱导黏连性膝关节强直家兔成纤维细胞凋亡的机制研究

目的观察盐酸青藤碱对膝关节黏连强直的家兔成纤维细胞增殖和相关基因表达的影响,并进一步尝试探讨其对抗膝关节黏连强直的作用机制。方法以体外培养法培养成纤维细胞,并设对照组、盐酸青藤碱低中高浓度实验组。CCK-8法检测成纤维细胞增殖的情况;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法检测经过盐酸青藤碱处理后,成纤维细胞相关基因mRNA表达的改变,用ELISA法检测药物的作用对血清中炎症因子等水平的影响,蛋白质印迹法(Western blot)检测相关蛋白质的表达。结果盐酸青藤碱能降低成纤维细胞存活率,且随浓度升高存活率逐渐降低。盐酸青藤碱中各个组的效果均十分明显(P<0.05)。在相关基因的mRNA表达层面,与对照组比较,盐酸青藤碱各组炎症因子均显著下调(P<0.05),凋亡蛋白的表达量显著上升、Bcl-2的mRNA表达量下降(P<0.05),而PI3K/mTOR/AKT3信号通路分子的mRNA表达量均下降(P<0.05)。在蛋白质表达层面,与对照组相比较,中、高剂量盐酸青藤碱组血清中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、TGF-β的水平均明显下调(P<0.05),凋亡蛋白cleaved-PARP、cleaved caspase-3/7及Bax的表达量均上调,并且与给药剂量成正相关,而抗凋亡蛋白Bcl-2、PI3K/AKT3/mTOR信号通路的表达量则与给药剂量成负相关。盐酸青藤碱对家兔膝关节成纤维细胞的存活表现为显著的抑制作用,作用机制或与下调炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β的表达,并促进凋亡蛋白cleaved-PARP、cleaved caspase-3/7及Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,抑制其下游PI3K/AKT3/mTOR信号通路的基因表达有关。结论盐酸青藤碱可抑制黏连性膝关节强直家兔膝关节成纤维细胞的炎症反应和加速成纤维细胞的凋亡,或可通过该机制为改善和治疗黏连性膝关节强直提供新的方法。

针刀疏筋解结术对类风湿关节炎家兔滑膜炎症的影响及作用机制研究

目的观察针刀疏筋解结术对类风湿关节炎(RA)模型家兔膝关节滑膜组织NF-κB/Bcl-2通路活性及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、Bax、caspase-3表达的影响,探讨其抑制RA滑膜炎症的作用机制。方法24只新西兰白兔随机分为正常组、模型组、药物组和针刀组,每组6只,除正常组外,其余组采用卵蛋白+弗氏完全佐剂膝关节腔注射复制RA模型,分别予相应干预,连续18 d。测定家兔膝关节痛阈、膝关节周径,超声观察关节腔积液、滑膜厚度及内部血流信号,HE染色观察膝关节滑膜组织形态,TUNEL染色观察滑膜组织成纤维样滑膜细胞(FLS)凋亡情况,免疫组化检测滑膜组织TNF-α、IL-1β、IL-6表达,RT-PCR检测滑膜组织核因子(NF)-κBp65、Bcl-2mRNA表达,Westernblot检测滑膜组织NF-κBp65、p-NF-κBp65、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达。结果与正常组比较,模型组家兔膝关节痛阈降低、膝关节周径增加,超声评分和滑膜组织病理评分增加;滑膜组织FLS凋亡率降低,TNF-α、IL-1β、IL-6表达升高,NF-κBp65、Bcl-2 mRNA和蛋白及p-NF-κBp65蛋白表达升高,Bax、caspase-3蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,药物组和针刀组家兔膝关节痛阈增加、膝关节周径减小,超声评分和滑膜组织病理评分减少;滑膜组织FLS凋亡率升高,TNF-α、IL-1β、IL-6表达降低,NF-κBp65、Bcl-2m RNA和蛋白及p-NF-κBp65蛋白表达降低,Bax、caspase-3蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论针刀疏筋解结术可能通过降低滑膜组织NF-κB/Bcl-2通路活性,促进FLS凋亡,减少TNF-α、IL-1β、IL-6产生,抑制RA滑膜炎症,减轻膝关节肿胀、提升痛阈。

兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞分离培养方法的研究

目的在传统细胞组织块培养方法的基础上进行改进,建立一种简单、可重复性操作的兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞分离培养方法。方法通过手术诱导建立兔膝骨关节炎模型,在无菌条件下,快速取出兔膝骨关节炎的滑膜组织,经过冲洗处理后剪成一定大小碎片,用无菌滤纸吸净组织上附着的水分,接种在培养皿后,进行观察、换液、传代、拍照。将原代培养的细胞传至第三代细胞接种于96孔板中,采用噻唑蓝(MTT)法分别在不同时间梯度检测各孔对应吸光度,制作生长曲线;采用免疫荧光染色法观察细胞中波形蛋白的表达情况。结果培养的细胞为典型的梭形,符合成纤维样滑膜细胞的生长形态特征,免疫荧光染色显示波形蛋白强表达。结论改进后的组织块培养方法简单、操作可重复性强,可以获得大量兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞,为后续膝骨关节炎的机理研究提供了大量细胞支持。

MMC对兔眼滤过道成纤维细胞活性的抑制作用

目的 应用细胞增殖指标核仁组成区相关嗜银蛋白(ＡｇＮＯＲｓ),研究兔眼滤过道成纤维细胞(Ｆｂ)增殖规律及丝裂霉素Ｃ(ＭＭＣ)的抗增殖作用,并对其临床意义进行探讨。方法取兔眼滤过道切片作ＡｇＮＯＲｓ及ＨＥ染色,比较ＭＭＣ眼和对照眼Ｆｂ ＡｇＮＯＲｓ染色颗粒数量。结果不同手术区ＭＭＣ眼Ｆｂ ＡｇＮＯＲｓ颗粒数显著低于对照眼,ＭＭＣ抑制率为５０．７％～８２．１％。结论丝裂霉素Ｃ可以有效抑制咬切口、巩膜瓣下、结膜瓣下Ｆｂ的增殖活性,抑制作用稍强于同类药物５－Ｆｕ。

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究(英文)

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine guaninephos phoribosyltransferase,HGPRT)的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关.制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究.构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%.RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRT mRNA和蛋白质表达量明显降低.最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著.说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件.

白藜芦醇对兔成纤维细胞氧化应激损伤的保护作用研究

为探讨白藜芦醇对成纤维细胞氧化应激损伤的保护作用,试验以兔成纤维细胞为研究对象,采用不同浓度的过氧化氢刺激兔成纤维细胞以建立氧化应激模型.通过CCK试剂盒(Cell Counting Kit)法检测白藜芦醇对兔成纤维细胞增殖的影响,以及检测分析白藜芦醇保护兔成纤维细胞免受过氧化氢损伤的效果.结果表明:用浓度为500μmol/L的过氧化氢刺激兔成纤维细胞,成功建立氧化应激模型.高浓度(100μmol/L及以上)白藜芦醇处理细胞24 h后会对活细胞产生损伤作用,细胞存活率显著降低.用50μmol/L浓度的白藜芦醇预处理氧化应激损伤模型后,由过氧化氢引起的细胞存活率下降得到显著改善.在一定浓度范围内,白藜芦醇可以减轻过氧化氢诱导产生的氧化应激损伤,在抵御细胞氧化应激损伤方面有保护的作用.

悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的:建立兔成纤维样滑膜细胞悬浮组织块分离培养法。方法:取正常兔膝关节滑膜组织,用悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞,观察细胞生长状况及形态特征,取第3代对数期细胞,CCK-8法绘制其生长曲线,免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况,并与组织块贴壁法进行比较。结果:两种方法体外培养得到的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的"S"形,免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论:悬浮组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,效率高,为体外分离培养兔成纤维样滑膜细胞提供了一种新的方法。

兔体细胞核移植的初步研究

实验以兔胎儿成纤维细胞为核供体 ,对兔体细胞核移植技术的融合、激活和发育等环节进行了初步研究。实验通过比较不同电场强度对兔 2细胞胚胎卵裂球融合以及卵母细胞激活的影响 ,证实 2 0 0和 2 60V mm的电场强度可有效地诱导 2细胞胚胎的融合和兔卵母细胞的孤雌激活。然后将 2 0 0和 2 60V mm电场强度用于体细胞核移植 ,融合率分别为 44 4%和 48 4% ,卵裂率分别为 5 8 8%和 5 3 8% ,桑椹胚 囊胚发育率分别为 5 9%和 5 5 %。但 1 1 2枚核移植胚胎移植到 5只受体后没有幼子出生。结果表明 ,实验中所建立的程序至少可以支持兔体细胞克隆胚胎的早期发育。

CCK-8法与MTT法检测兔成纤维细胞活性的比较研究

目的:探讨CCK-8法和MTT法检测兔成纤维细胞活性的最佳实验条件,并比较其优略。方法:以传至第3代的兔成纤维细胞为研究对象,分别用CCK-8法和MTT法检测兔成纤维细胞的增殖活性。结果:MTT法的最佳检测波长490nm,CCK-8法最佳检测波长为450nm,两法的最佳检测时间均为加入试剂后4h。适宜检测的细胞数量范围为2×103/ml～1×105/ml个。结论:CCK-8法较MTT法检测的灵敏度高,准确性好,是一种优于MTT法的检测兔成纤维细胞增殖活性的方法。

改良组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单,可行的兔成纤维样滑膜细胞体外培养方法。方法无菌条件下取正常兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞,用CCK-8法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况。结果体外培养的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的"S"型,免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论改良组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求。

兔角膜成纤维细胞培养及其生长抑制的实验研究

目的了解丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）及透明质酸（ＨＡ）对准分子激光屈光性角膜切削术（ＰＲＫ）术后及正常兔角膜成纤维细胞增殖的影响。方法对兔角膜成纤维细胞体外培养，观察ＭＭＣ及ＨＡ对细胞生长的影响。结果ＭＭＣ及ＨＡ对兔角膜成纤维细胞生长具有明显的抑制作用。结论从细胞生物学角度揭示ＭＭＣ及ＨＡ作为能有效抑制体外培养角膜成纤维细胞增殖的药物，作为ＰＲＫ及其它眼科手术后用药的可能性，以期有助于防止或减少手术并发症。

电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究

目的采用电穿孔方法，介导质粒载体pEGFP-cl转入兔成体成纤维细胞，探讨建立电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的基本条件。方法电穿孔介导质粒载体pEGFP—cl转入7．10代兔耳成体成纤维细胞系GG，研究不同电压、电容、DNA剂量，孵育温度的条件下，观察细胞存活数，流式细胞仪测试GFP的含量。结果以PBS作为电击基础液、细胞浓度2×10^6个／ml，电压250V、电容700μF，DNA用量30μg时，兔耳成纤维细胞的转染率和存活率最佳。且电击前冰浴10min，电转染后37℃孵育10min有利于提高细胞的转染率和存活率。结论在合适电压、电容、DNA剂量条件下，电转染提供了外源基因转染兔耳成体成纤维细胞适用性；电转染前的一定时间冰浴和电转染后一定温度孵育可使电转染效率得到改善。

CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性之最佳测试条件研究

目的研究CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞(RFFBs)增殖活性的最佳测试条件。方法以兔筋膜作为成纤维细胞原代培养组织,利用传代至P3的成纤维细胞,对比CCK-8法在不同孵育时间及不同检测波长条件下吸光光度值的差异,研究CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性的最佳检测时间及最佳检测波长。结果 CCK-8法检测兔筋膜成纤维细胞增殖活性的最佳检测时间为加入CCK-8试剂孵育后的4 h,最佳检测波长为450 nm。结论 CCK-8法在孵育4 h后及酶标仪450 nm波长下检测兔筋膜成纤维细胞的灵敏度最高。

感染伤口愈合过程中负压引流对成纤维细胞的影响

目的了解负压引流在感染伤口愈合过程中成纤维细胞数量的变化。方法选取40只成年健康日本大白兔,在颌面部、大腿部建立感染伤口模型,按数字随机表法分为实验组和对照组各20只,实验组清创后负压引流,对照组常规方法处理。两组于清创后1、3、5、7 d处死动物,取创面标本光镜下计数成纤维细胞。结果术后第1天实验组腿部成纤维细胞数量明显多于对照组(P<0.05);术后第1、3天实验组面部成纤维细胞数量多于对照组(P<0.05)。结论负压引流可促进感染伤口成纤维细胞计数增加,从而加速伤口愈合。

改良组织块法分离培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞

目的 通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单、可行的佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞（FLS）体外培养方法并观察细胞生物学特性.方法 通过注射弗氏完全佐剂建立关节炎模型,无菌条件下取佐剂性关节炎兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征.取第3代对数期细胞,用噻唑蓝（MTT）法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况.结果 体外培养的佐剂性关节炎兔FLS形态为长梭形纤维样,符合FLS的生长特征,免疫荧光检测显强表达波形蛋白.结论 改良组织块法可以分离培养出兔佐剂性关节炎成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求.

兔皮肤成纤维细胞的体外培养和NESTED-PCR支原体污染检测

[目的]为动物细胞核移植、转基因操作等提供充足的供体材料。[方法]通过对兔皮肤成纤维细胞的体外原代、传代培养和冷冻复苏,检测支原体污染状况。[结果]结果表明:在含有15%FCS(Fetal Calf Serum)的DMEM中培养的细胞初期生长状态较10%FCS中的细胞长势好,后期则相反。用PCR法对培养至25代的兔皮肤成纤维细胞进行支原体检测,均没有发现支原体污染现象。[结论]PCR法检测细胞培养支原体污染具有灵敏、准确、简便、快速、特异性好的优点。

体外诱导成纤维细胞成骨活性表达的研究

目的探讨成纤维细胞(fibroblast,FB)体外成骨表达的诱导因素,为其能否成为骨组织工程的种子细胞提供理论依据。方法分离和纯化新西兰兔肉芽组织FB,按1×105/ml分别接种于含纤维结合蛋白(fibronectin,FN)10、20、40、60、80μg/ml条件培养液中(实验1～5组),对照组为不含FN的无血清培养液。于培养14d后,行细胞组织学观察及钙化结节形成率、趋骨性四环素荧光标记、3H-TdR标记、骨钙素测定及3H-脯氨酸标记,检测FB成骨表型表达的标志。结果组织学观察实验组发现FB由梭形逐渐趋向多突形和圆形,细胞核偏向一侧,细胞重叠成多层结构;其表面有钙盐堆积,逐渐呈云雾状物质,经不断融合和扩大形成不透光的结节。干预培养14d钙化结节形成率:对照组15.35%±3.45%,实验1～5组分别为53.73%±9.49%、75.21%±9.80%、98.34%±15.20%、61.83%±10.04%、45.11%±8.70%,实验组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);实验3组与其它各实验组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。趋骨性四环素特异性标记为新生骨组织;FB增殖活性,实验3、4、5组7d时,实验2、3、4组14d时与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验1～5组FB分泌骨钙素,实验2～5组3H-脯氨酸掺入量高于对照组,7、14d时与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论适量的FN可以促进FB增殖、胶原蛋白的合成及骨钙素分泌,FN可以诱导FB成骨表达,适宜浓度为40～60μg/ml。

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的 :动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法 :选用 2～ 3kg新西兰大白兔 6 4只 ,分为 2大组 ,快速扩张组和常规扩张组 ,每组 32只 ,每大组再分为 4组 ,为扩张完成后即时、1周、12周、2 4周组 ,每组 8只 ,其中 4只为实验组 ,另 4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果 :表皮扩张后经历一由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生 ,功能由静止转向活跃 ,胶原纤维碎裂成片 ,弹力纤维部分断裂 ,炎症细胞浸润 ;扩张后 1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复 ,显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后 12周、2 4周 ,成纤维细胞趋于稳定、形态狭长 ,部分胶原排列紊乱 ,部分有似瘢痕样改变。结论 :扩张刺激可致兔皮肤创伤 。