冬凌草愈伤组织诱导及细胞培养的研究

用组织培养、细胞悬浮培养和单细胞平板培养技术，诱导出冬 凌草愈伤组织，并探讨 了细胞悬浮培养时间、培养方法和接种密度对冬凌草单细胞平板培养植板率的影响。结果表 明：从冬凌草叶和嫩茎诱导愈伤组织，以 MS+2，4D 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L 培养基较好 ，愈 伤组织诱导率高达 96.80%。用普通单细胞平板培养法培养冬凌草单细胞的植板率很低，而 以悬浮培养 15～18 d 的单细胞为材料，接种密度为 5×103个/毫升时，进行条件培养 和 看护培养，植板率达 21.63%。本研究结果可供利用细胞培养技术筛选冬凌草高产冬 凌草素细胞株时参考。

冬凌草甲素通过诱导人宫颈癌HeLa细胞自噬下调凋亡的机制

研究冬凌草甲素通过诱导人宫颈癌HeLa细胞自噬拮抗凋亡的机制。MTT法测定冬凌草甲素对HeLa细胞的细胞毒作用。通过相差显微镜观察细胞形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化,用流式细胞仪检测细胞自噬和凋亡水平,用Westernblotting检测分析药物对蛋白质表达的影响。冬凌草甲素明显抑制HeLa细胞的增殖,诱导HeLa细胞凋亡,同时诱导HeLa细胞发生自噬。Westernblotting检测结果表明,冬凌草甲素作用24h后,促凋亡蛋白Bax、细胞色素c和控制Bax活力的去乙酰化酶SIRT-1的表达明显改变。冬凌草甲素(64μmol.L-1)诱导的自噬通过影响SIRT-1和线粒体途径蛋白的表达下调凋亡。

氮碳源对冬凌草再生植株生长及次生代谢产物的影响

以冬凌草再生植株为研究材料,通过改变培养基中蔗糖浓度及NO3-/NH4+比例,研究冬凌草再生植株的生长状况及植株体内次生代谢物的积累规律.结果表明:3%蔗糖有利于冬凌草再生植株的生长和冬凌草甲素的积累,5%蔗糖有利于迷迭香酸的积累;NO3-/NH4+比例过高或过低均不利于再生植株的生长和次生代谢产物的积累,二者比例为2∶1时再生植株生长和次生代谢产物积累最佳.说明不同蔗糖浓度及NO3-/NH4+比例对冬凌草再生植株的生长和次生代谢物合成有明显的影响.

不同植物激素对冬凌草愈伤组织增殖及褐化的影响

研究了不同种类的植物激素对冬凌草叶片诱导愈伤组织及褐化的影响,结果表明:培养基中植物激素的种类、浓度及其组合对愈伤组织增殖及褐变影响较大。适宜浓度的2,4-D、IAA和NAA生长素、KT和6-BA细胞分裂素及GA3,能不同程度地减轻或抑制褐化,促进愈伤组织的生长,其中以2,4-D(2.5)+KT(0.2)+GA3(0.2)效果最好。

冬凌草组织培养及其愈伤组织诱导研究

实验采用L9(34)正交试验方法优化冬凌草组织培养快繁培养基,筛选冬凌草增殖、生根和愈伤组织诱导的最佳培养基配方。结果表明:不定芽诱导的最适培养基为MS+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA;生根培养基为1/2 MS+1 mg/L IBA+1 g/L活性炭;以冬凌草茎段为外植体诱导愈伤最佳培养基为MS+1.5 mg/L6-BA+2 mg/L2,4-D。

氮源和碳源对冬凌草愈伤组织生长及迷迭香酸的积累的影响

目的研究碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长及其内迷迭香酸积累的影响。方法改变培养基中蔗糖浓度和碳源种类,考察不同碳源及其浓度对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响。在总氮源不变的情况下改变NO3-/NH4+的比例,考察不同NO3-/NH4+比例对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响。结果蔗糖是冬凌草愈伤组织培养中的最佳的碳源,其浓度为3%时,有利于冬凌草愈伤组织的生长和迷迭香酸的积累;NO3-/NH4+比例为1∶1时,愈伤增值倍数最高;NO3-/NH4+比例2∶1时,迷迭香酸的积累量最大。结论实验确定了冬凌草愈伤组织培养的最佳碳源种类、浓度及氮源比例,表明不同碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长和次生代谢物合成有显著影响。

冬凌草离体培养体系的建立及主要次生代谢产物的测定

以冬凌草叶片为外植体,研究不同浓度激素组合对冬凌草愈伤组织诱导及植株再生的影响,并对不同外植体(茎、叶)诱导愈伤、芽的分化能力及再生植株内主要次生代谢产物的含量进行了比较研究。结果表明:在MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA培养基上诱导愈伤组织效果较好;在MS+2.0 mg/L 6-BA的培养基上诱导芽的效果较好;叶片和茎段在愈伤诱导培养基上均能产生大量的愈伤组织,但其再分化能力以茎段最好;再生苗生根培养基以0.3 mg/L IBA最好;以叶为外植体诱导的再生植株中冬凌草甲素、迷迭香酸的含量均高于以茎为外植体诱导的再生植株。

冬凌草化学成分研究

对唇形科香茶菜属植物冬凌草进行化学成分研究,从其中分得7个化合物,经理化和波谱方法分别鉴定为:双冬凌草丁素(Ⅰ),(10Z,14Z)-9,16-二羰基-10,12,14-三烯-十八碳酸(Ⅱ),2′-乙酰氨基-3′-苯基丙基2-苯甲酰氨基-3-苯基丙酸酯(Ⅲ),α-香树脂醇(Ⅳ),β-香树脂醇(Ⅴ),2β-羟基齐墩酸(Ⅵ),2α-羟基乌索酸(Ⅶ)。其中化合物Ⅰ为一个新的对映-贝壳杉烷二萜二聚体,Ⅱ为新的高度不饱和脂肪酸,化合物Ⅲ和Ⅵ为首次从该属植物中得到,化合物Ⅴ为首次从该植物中得到。

抗癌植物冬凌草种质资源遗传多样性分析

为了评价、管理和利用抗癌植物冬凌草(Rabdosiarubescens)的种质遗传资源,采用ISSR分子标记对其7个自然居群进行了遗传多样性分析。结果表明:冬凌草在物种水平具有中等的遗传多样性(Ppl:60.45%,H:0.2714,I:0.3365,HB:0.3108),在居群水平具有较低的遗传多样性(Ppl:17.05%,H:0.0692,I:0.0989,HB:0.0763),居群间存在较高的遗传分化(GST:0.6515,θB:0.6388,GST-B:0.6095)。基于遗传距离的UPGMA聚类中,位于华西的四川(SC)居群和中南的保靖(BJ)和石门(SM)居群组成核心分支,再分别与向南和向北的居群聚合。因此,ISSR分子标记适合于冬凌草遗传多样性研究,对其核心种质库的构建具有指导作用。

冬凌草的质量控制研究

目的采用HPLC法建立冬凌草的质量控制方法。方法ShimpackCLCODS(150mm×46mm)为色谱柱,甲醇和05%磷酸采用梯度洗脱,检测波长280nm,流速08mLmin,柱温25℃。结果精密度、重复性和稳定性试验中各共有峰相对保留时间的RSD均小于3%,符合有关规定。结论本方法可以作为控制冬凌草内在质量的方法之一。

植物生长物质对冬凌草愈伤组织生长及褐化的影响

研究了不同种类植物生长物质对冬凌草愈伤组织生长及褐化的影响,结果表明:培养基中植物生长物质的种类、浓度及其组合对愈伤组织生长及褐变起着重要的作用;适宜浓度的生长素(2,4!D、NAA和IBA)、细胞分裂素(6!BA和KT)、GA3能不同程度地促进愈伤组织的生长,减轻或抑制褐化作用,其中以2 mg/L2,4!D+0.2 mg/LKT+0.5 mg/LGA3效果最好。

冬凌草二萜类成分的化学指纹图谱研究及评价

为了建立冬凌草(Rabdosia rubescens)二萜类成分的HPLC指纹图谱,并通过指纹图谱对来自不同产地和不同类型的冬凌草进行评价,本研究以10批太行山产冬凌草HPLC色谱图为参照,建立了冬凌草二萜类成分的指纹图谱,色谱条件为,色谱柱:phenomsil C18(250×4.6 mm,5μm)柱;流动相:甲醇∶0.5%磷酸水溶液梯度洗脱;柱温:30℃;检测波长:238 nm;流速:0.8 mL/min。通过化学成分指纹图谱相似度分析以及主成分分析方法,综合评价不同产地冬凌草样品质量的差异。结果表明冬凌草种质资源出现多种分化,不同地区冬凌草二萜类成分差异明显;不同变异类型冬凌草二萜类成分也发生了变化,但没有明显规律性。

冬凌草的染色体数目及核型分析

利用Gimesa显带技术对冬凌草进行了染色体数目和染色体核型分析,研究结果表明:冬凌草染色体数目为2n=2x=24,相对长度组成为2n=2x=24=10M2+14M1,核型公式为K(2n)=2x=24=16m+8sm.所研究中,G-显带条纹数目虽然有限,但能准确的反映染色体结构特点,从而提高染色体识别的准确性和核型分析的精确性.从染色体水平初步推测冬凌草在系统演化上可能属于较原始的种类.

栾川冬凌草挥发油成分的GC-MS分析

对河南栾川老君山产中草药冬凌草的挥发油进行研究。用水蒸汽蒸馏方法提取冬凌草中的挥发油 ,用GC -MS方法对冬凌草挥发油的化学成分进行了鉴定 ,从挥发油中鉴定出 14个化合物。采用气相色谱 -质谱 (GC -MS)对河南栾川老君山产冬凌草挥发油成分进行了分析 ,分离出了 2 8个峰 ,确认了

冬凌草的性状及显微鉴别

目的为鉴别和进一步研究开发冬凌草提供方法依据。方法采用石蜡切片法观察茎、叶的解剖结构,用水合氯醛透化法观察冬凌草茎叶粉末的显微特征,并观察其原植物和药材性状。结果描述了冬凌草的原植物和药材性状的特征,确定了其茎叶及粉末的显微鉴别特征。结论此研究结果可为冬凌草的鉴别和进一步开发利用冬凌草提供依据。

HPLC法测定冬凌草药材中冬凌草甲素和迷迭香酸的含量

目的:建立冬凌草中冬凌草甲素和迷迭香酸的含量测定方法,为冬凌草质量标准的研究提供科学依据。方法:采用高效液相色谱法测定不同产地冬凌草及不同部位中冬凌草甲素和迷迭香酸的含量。色谱条件为Phen-omsil C18(150 mm×4.6 mm,5μm)柱;甲醇-0.3%磷酸水溶液(40∶60)为流动相;冬凌草甲素、迷迭香酸的检测波长分别为238 nm、329 nm。结果:冬凌草甲素、迷迭香酸的平均加样回收率分别为97.1%、99.3%,RSD分别为2.8%、2.9%。结论:本方法精密度高,分离度良好,可用于测定冬凌草中冬凌草甲素和迷迭香酸的含量。

光质对冬凌草无菌苗生长及冬凌草甲素含量的影响

目的研究不同光质对冬凌草无菌苗生长及其中冬凌草甲素含量的影响。方法将冬凌草的种子在不同光质的培养箱中培养出无菌苗,观察无菌苗生长情况,并采用高效液相法测定其中冬凌草甲素的含量。结果无菌苗在白光下长势最好,叶片较多;在红光下无菌苗长势其次,株高增长最快;在黄光、绿光、蓝光条件下长势较差;黑暗条件下长势最差,植株发黄。不同光质下冬凌草甲素含量从高到低依次为:白光(0.155%)>红光(0.145%)>黄光(0.117%)>蓝光(0.035%)>黑暗(0.031%)>绿光(0.027%)。在白光和红光下培养的冬凌草无菌苗中冬凌草甲素含量显著高于其它光质下培养的冬凌草无菌苗。结论不同光质对冬凌草无菌苗的生长状况和冬凌草甲素的含量有很大影响,白光和红光有利于冬凌草无菌苗的生长和冬凌草甲素的积累。

冬凌草化学成分积累动态的研究

目的:分析冬凌草化学成分的积累动态。方法:采用中国药典(2005年版)的方法进行水溶性浸出物、醚溶性浸出物的测定;用高效液相色谱法测定冬凌草中冬凌草甲素、迷迭香酸的含量。结果:冬凌草中水溶性浸出物、醚溶性浸出物、冬凌草甲素、迷迭香酸的含量在不同生长时期有明显的变化规律。结论:冬凌草中化学成分动态积累的变化规律,将为研究冬凌草生物特性的形成及冬凌草的规范化种植提供科学依据。

冬凌草异戊烯基焦磷酸异构酶基因(IDI)克隆与分析

以冬凌草无菌苗为试验材料,在冬凌草转录组信息数据的基础之上,采用逆转录PCR技术克隆到冬凌草二萜类合成的关键酶基因:异戊烯基焦磷酸异构酶基因(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI),并对该基因进行了相关的生物信息学分析。结果表明:IDI cDNA基因全长1 050bp,基因开放阅读框为906bp,编码301个氨基酸,其蛋白质序列理论分子量为27.4kDa,等电点为5.06,是一种亲水性蛋白。采用实时荧光定量PCR法分析其组织表达模式,发现IDI在叶中表达量相对较高,在愈伤组织中表达量最低。

氮磷钾对冬凌草中迷迭香酸积累影响的研究

目的研究氮、磷、钾3种养分对冬凌草中迷迭香酸含量积累的影响。方法采用3因素2次饱和-D最优盆栽施肥试验设计,对冬凌草中迷迭香酸积累进行肥效研究。结果磷肥对迷迭香酸的积累作用最为显著,氮磷肥共同施用时可使冬凌草中迷迭香酸含量增加一倍。结论营养元素对冬凌草中代谢产物的积累中有明显的调节作用,合理施肥能够有效地调节代谢产物合成与积累。