Rac1-GTPase慢病毒的构建及生物学活性鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白的Rac1-GTPase显性负效突变体(Rac1N17)和组成型活性突变体(Rac1L61)的慢病毒。方法构建Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒,并以酶切和测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统包装制备Rac1-GTPase突变体慢病毒上清,用其感染大鼠前皮质神经元,分别进行Rac1生物学活性检测、细胞转染效率鉴定与神经元形态学观察。结果构建的Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒经酶切与测序鉴定正确,包装的慢病毒滴度为1×106TU/ml。用制备的慢病毒上清感染原代培养的前皮质神经元,Rac1生物学活性检测结果显示Rac1N17慢病毒显著抑制表皮生长因子诱导的Rac1活性的升高,而Rac1L61慢病毒感染神经元Rac1活性显著升高。感染效率鉴定显示病毒上清可感染80%以上的前皮质神经元。形态学观察显示经慢病毒感染后的神经元其胞体与树突分支清晰可见。结论成功制备了Rac1N17和Rac1L61慢病毒,并成功实现了慢病毒感染前皮质神经元,为进一步研究Rho蛋白家族信号通路提供了一个重要工具。

阴道毛滴虫Rac1蛋白的cDNA克隆和序列分析(英文)

目的 获得阴道毛滴虫Rac1蛋白的cDNA克隆 ,研究其在细胞周期中的调解作用。 方法 提取阴道毛滴虫总RNA ,构建cDNA表达文库 ,随机分离cDNA克隆并测序。用在线生物分析软件NCBIBLAST、ClustalW以及Treeview等程序进行序列分析。 结果 获得一株有 714bp的cDNA克隆。序列分析表明 ,该克隆开放阅读框具 60 0bp ,推测肽链具 2 0 0个氨基酸。该肽链与Rho家族中Rac1鸟苷三磷酸 (GTP)酶同源性最高 (>60 % ) ,并具多种RhoGTP酶的保守基序 ,如GTP结合部位、GTP酶激活蛋白作用基序、GTP分离抑制因子作用基序、鸟嘌呤核苷酸交换因子作用基序等。进化树分析显示该克隆属于Rac亚家族GTP酶 ,与原虫Rac1蛋白最接近。 结论 该克隆属RhoGTP酶的Rac亚家族 ,很可能是阴道毛滴虫的Rac1蛋白。

组成活化型Rac1 GTP酶通过上调促血小板血成素受体的表达促进白血病细胞的静息

目的:研究Rac1 GTP酶的活化对白血病细胞静息的影响,并探索其机制。方法:构建Rac1组成活化型慢病毒载体,以此感染急性髓系白血病KG-1a细胞,比较感染了组成活化型Rac1的KG-1a(Rac1-V12-KG-1a)细胞和感染空载体的KG-1a(pCDH-KG-1a)细胞在G0期的比例差异。以Rac1特异性抑制剂NSC23766处理感染后KG-1a细胞,4 d后检测两组细胞G0期比例的变化。实时定量PCR检测两组细胞中与细胞周期和细胞静息相关分子的表达。流式细胞术检测小鼠Rac1GTP酶高度活化的AMLI-ETO9a白血病细胞模型中促血小板生成素受体(myeloproliferative leukemia MPL)-和MPL+细胞群在G0期的比例。结果:感染了组成活化型Rac1的Rac1-V12-KG-1a细胞的G0期细胞比例显著高于感染空载体的p CDH-KG-1a细胞的比例[(15.30±0.60)%vs(11.50±0.17)%,P<0.05];抑制剂处理KG-1a细胞后,随着抑制剂浓度的增加G0期细胞比例显著下降(P<0.05)。实时定量PCR检测结果显示,周期抑制因子P21、P27、P57的mRNA表达水平在Rac1-V12-KG-1a细胞表达均有不同程度的上调,静息相关调节分子N-Cadherin和MPL m RNA表达水平均显著升高(P<0.05);流式检测结果显示,MPL+白血病细胞群的比例在G0期显著高于MPL-组[(40.3±3.5)%vs(19.05±7.65)%,P<0.05]。结论:白血病细胞中Rac1 GTP酶的活化通过上调MPL等细胞外在调节因子的表达增加休眠期细胞的比例,从而促进白血病细胞维持静息状态。

Rho GTPases与肿瘤

Rho GTPases参与调控细胞的多种关键生物学行为,特别是细胞的生长、细胞骨架的形成、转录调节等生物学过程.在肿瘤的发生发展中Rho GTPases也扮演了重要的角色.本文将回顾Rho GTPases的调控(包括经典及非经典调控方式)及其关键成员(Rho A、Cdc42及Rac1)与临床肿瘤的研究进展,特别是它们参与调控肿瘤的增殖、迁移、侵袭、凋亡等恶性生物学行为,从而为研发靶向Rho GTPases的小分子/基因药物了奠定基础.

缺氧状况下Rho GTPases的表达和活性变化及其与肿瘤血管生成关系的研究

目的 探讨RhoGTPases在缺氧状态下的表达和活性变化以及与缺氧诱导的肿瘤血管生成的关系。方法 提取胃癌细胞AGS、SGC790 1和肝癌细胞HepG2 的总RNA ,采用半定量RT PCR检测缺氧状况下RhoGTPases家族分子的mRNA表达水平 ;应用Rho蛋白活性检测试验进一步检测其活性 ;Westernblot检测肿瘤血管生成相关分子HIF 1α、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、p5 3和PTEN的表达水平。结果 缺氧状况下 ,多种肿瘤细胞系中Rac1的mRNA表达水平均明显增高 ;Rac1活性迅速升高 ,约 3h达到高峰 ,且其活性与HIF 1α、VEGF呈正相关 ;而与p5 3、PTEN呈负相关。结论 Rho家族蛋白分子Rac1在缺氧诱导下被激活 。

Rac1基因真核表达质粒的构建及其对结肠癌细胞生物学功能的影响

目的应用分子生物学技术构建Rac1基因真核表达质粒及小分子RNA(siRNA)干扰片段,通过调控其表达,研究Rac1蛋白对结肠癌细胞生物学功能的影响。方法从结肠癌细胞中扩增Rac1基因,构建pCDNA3.1(+)-Rac1和pEGFP-Rac1真核表达质粒实现过表达Rac1基因;通过小分子RNA干扰抑制Rac1基因表达。利用侵袭实验、划痕实验研究Rac1基因对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的改变;通过Pull-Down实验,研究调控Rac1表达对癌细胞中GTPase活性的影响。结果成功构建Rac1基因真核表达质粒。通过调控Rac1蛋白的表达证实其与结肠癌细胞中Rac1GTPase的活化程度,以及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力呈正性关联。结论通过抑制Rac1的表达,可以有效阻止Rac1 GTPase的激活,从而抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭,为抑制结肠癌进展提供新的干预靶点,也为进一步免疫生物过继治疗提供了必要的实验基础。

Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)的研究进展

Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)是Rho GTP酶家族的Rac亚家族中的一员。该家族编码的蛋白质因分子量只有20~30 ku而被称为小G蛋白,具有GTP酶活性,在多种细胞反应中具有开关作用。Rac1有多种生物学功能,可调控细胞极性、吞噬作用、细胞迁移、囊泡的转运以及调节肌动蛋白骨架的形成等。从研究概况、作用机制、生物学功能等方面,对Rac1基因的研究进展进行了综述,以期为进一步阐明Rac1的生物学功能及其作用机理提供理论依据。