RNA干扰Rac1基因表达对结直肠癌LoVo细胞骨架和细胞周期的影响

目的:观察Rac1蛋白在结直肠癌细胞中的表达,并分析其与结直肠癌LoVo细胞骨架、细胞周期和细胞凋亡的相关性。方法:Western blotting测定5种结直肠癌细胞株(LoVo,SW480,SW620,SW1116,HT29)中Rac1蛋白的表达;Rac1-shR-NA质粒转染LoVo细胞后,激光共聚焦显微镜观察LoVo细胞骨架的变化,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化。结果:5种结直肠癌细胞株中均有Rac1蛋白的高表达。Rac1基因沉默后,LoVo细胞中交联状态的F-actin网明显减少且紊乱,G0/G1期细胞比例较对照组显著增加[(74.63±4.40)%vs(56.46±3.09)%,P<0.05],而S期细胞比例较对照组显著减少[(12.87±1.77)%vs(29.66±1.92)%,P<0.05];Rac1-shRNA转染组LoVo细胞凋亡率较对照组显著增加[(25.31±2.05)%vs(9.38±1.16)%,P<0.05]。结论:RNA沉默Rac1基因的表达影响了LoVo细胞骨架的形成和细胞周期,为以Rac1为靶点治疗结直肠癌提供了实验依据。

RAC1基因多态性对Rac1-GTP蛋白表达水平的影响

目的:考察RAC1基因多态性与Rac1-GTP蛋白表达水平的相关性。方法:选择182例健康汉族志愿者,经Taq Man-MGB探针等位基因分型技术测定RAC1基因中的4个标签单核苷酸多态性(tag single nucleotide polymorphism,tagSNPs)位点的基因型,采用酶联免疫吸附法测定其血浆中的Rac1-GTP蛋白表达水平。分析Rac1-GTP蛋白表达水平的分布特点;对RAC1基因4个tag-SNPs不同基因型间Rac1-GTP蛋白表达水平进行比较。结果:Rac1-GTP蛋白表达水平在健康汉族人群中呈现正偏态分布,女性中的表达水平高于男性(P<0.05);随着年龄的增加有降低的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。Rac1-GTP蛋白表达水平在位点rs702482和rs10951982基因型间存在显著性差异(P<0.05),但在位点rs702483和rs6954996基因型间无统计学差异(P>0.05)。结论:在健康汉族人群中RAC1基因多态性存在影响Rac1-GTP蛋白表达水平的SNP位点。

RNA干扰Rac1基因表达抑制胃癌细胞增殖及促进凋亡的机制研究

目的 RNA干扰抑制Rac1基因的表达对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 Western blot检测胃癌组织及相应的癌旁组织中Rac1基因的蛋白表达;将NC-siRNA、Rac1-siRNA转染至人胃癌SGC-7901细胞,不经任何处理的细胞作为空白对照组,48 h后,Western blot检测各组细胞中Rac1的蛋白表达;CCK8实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测ki67、PCNA、Cleaved caspase3、Notch1、Hes1蛋白表达。结果 Rac1在胃癌组织中的蛋白表达显著高于癌旁组织(P<0.01);RNA干扰SGC-7901细胞中Rac1基因后能显著降低Rac1的蛋白表达;与对照组及NC-siRNA组比较,Rac1-siRNA组细胞存活率及ki67、PCNA、Notch1、Hes1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论 Rac1基因在胃癌组织中高表达,RNA干扰抑制Rac1基因表达后能显著降低细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与抑制Notch1信号通路有关。

长链非编码RNA MEG3靶向Rac1抑制宫颈癌细胞增殖、迁移的实验研究

目的检测长链非编码RNA MEG3在宫颈癌细胞中的表达,检测MEG3表达对He La细胞增殖、迁移的影响及可能分子机制。方法采用荧光定量PCR(QPCR)检测正常宫颈上皮细胞Hcer Epic和宫颈癌细胞系C-33A、C4-1、Caski、Si Ha和He La中MEG3的表达; MEG3过表达质粒(MEG3)、阴性对照质粒(NC组)、MEG3+Rac1过表达质粒(MEG3+Rac1组)分别转染He La细胞,MTT法检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测PCNA、E-cadenin、N-cadenin、Vimentin、Rac1蛋白表达。结果 QPCR结果显示,C-33A、C4-1、Caski、Si Ha和He La细胞中MEG3表达水平分别为0. 37±0. 044、0. 65±0. 075、0. 41±0. 071、0. 71±0. 053和0. 42±0. 081,均低于Hcer Epic细胞的1. 02±0. 064,差异具有统计学意义(P<0. 05)。MTT法结果显示MEG3组He La细胞增殖活力显著低于NC组; MEG3组的迁移细胞数为385±14,显著低于NC组的594±16(P<0. 05);与NC组比较,MEG3组PCNA、N-cadenin和Vimentin表达下调,E-cadenin表达上调。与MEG3组比较,MEG3+Rac1组显著上调Rac1蛋白表达,上调He La细胞增殖活力,增加迁移细胞数。结论 LncRNA MEG3可能通过靶向Rac1信号通路抑制宫颈癌细胞增殖、迁移。

siRNA靶向Rac1真核表达载体的构建与效应检测

目的构建、纯化并鉴定Rac1特异性siRNA的真核表达载体,并在HeLa细胞中初步检测其转染率及对Rac1基因的抑制率。方法体外合成含针对人、鼠的Rac1特异基因序列的siRNA链,定向克隆至pSUPER质粒中,对重组质粒进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。将抽提的质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜观察转染效率,荧光定量RT-PCR法鉴定其抑制Rac1基因表达的效果。结果利用RNAi技术成功构建抑制Rac1表达的小干扰RNA重组载体,并成功转染到HeLa细胞中(载体转染率达到70%以上)。在mRNA水平对Rac1基因的表达产生明显抑制作用(抑制率为87%以上)。结论成功构建了针对Rac1的siRNA真核表达载体,为进一步研究Rac1的功能奠定了基础。

鸡RAC1基因真核表达载体的构建及其在颗粒细胞中的表达验证

为构建鸡RAC1基因真核表达载体并观察该载体是否在鸡卵泡颗粒细胞中表达,试验采用PAS方法合成RAC1基因,先将其克隆至pUC57-simple载体中,然后再亚克隆至表达载体pYr-adshuttle-4上,将重组载体瞬时转染至鸡卵泡颗粒细胞中,通过荧光定量PCR和Western Blot进行验证。结果表明,RAC1基因正确地插入到了载体pYr-adshuttle-4的多克隆位点,且重组载体转染成功。试验成功构建了鸡源pYr-adshuttle-4-RAC1真核表达载体,并成功将其转入到鸡卵泡颗粒细胞中。该载体的构建为进一步研究RAC1的生物学功能提供了重要工具。

马身猪和大白猪背最长肌Rac1基因发育性表达研究

[目的]探究Rac1基因mRNA和蛋白质在马身猪和大白猪背最长肌组织中的发育性表达规律,揭示Rac1基因与猪肌肉发育之间的关系。[方法]采用qRT-PCR和Western blot技术检测马身猪和大白猪从1日龄到180日龄(1、30、60、90、120、150和180日龄)阶段背最长肌中Rac1基因的表达规律。[结果]Rac1基因mRNA在大白猪1日龄、120日龄和180日龄时表达量较高,与其他日龄相比差异极显著(P<0.01),其他日龄表达量均维持在较低水平;马身猪60日龄时Rac1 mRNA表达量最高,极显著地高于其他日龄(P<0.01),90日龄次之,其他日龄表达水平较低,且日龄间表达量无显著差异。在蛋白质水平上,从1日龄到180日龄,大白猪Rac1表达量整体呈先降低后升高的趋势,在1日龄时表达量最高,120日龄表达量最低;马身猪整体呈先升高后降低的趋势,60日龄时表达量最高,极显著高于其他日龄(P<0.01),随后几个月龄的表达量处于较低水平,显著低于1日龄和30日龄(P<0.05)。品种间比较,马身猪Rac1蛋白表达量始终高于大白猪,且在1日龄和60日龄,差异极显著(P<0.01),在120日龄和150日龄,差异显著(P<0.05)。[结论]猪背最长肌中Rac1基因mRNA和蛋白质的表达量与猪的年龄及遗传背景有关。

萤光素酶报告基因细胞模型在筛选靶向调控RAC1的大黄酸衍生物中的应用

目的 构建含RAC1启动子萤光素酶报告基因CNE1-RAC1-Luc2稳转细胞模型,探讨其在转录水平筛选靶向调控RAC1抗肿瘤活性的大黄酸衍生物中的应用。方法 利用RAC1启动子序列,设计合成萤光素酶报告基因-慢病毒重组载体,感染鼻咽癌CNE1细胞,获得稳定表达萤光素酶的细胞;采用萤光素酶报告基因检测试剂盒,检测RAC1激活剂PMA和抑制剂NSC23766刺激该细胞后的萤光素酶发光值,并观察系列大黄酸衍生物对RAC1启动子萤光素酶活性的影响,Western blot验证细胞RAC1蛋白表达的变化。结果 双酶切实验显示,含RAC1启动子萤光素酶报告基因的慢病毒表达载体构建成功;经嘌呤霉素筛选,获稳定表达萤光素酶的CNE1-RAC1-Luc2细胞,转染效率达90%以上;RAC1萤光素酶报告基因检测系统对RAC1激活剂和抑制剂反应灵敏,萤光素酶活性与Western blot实验中RAC1蛋白表达结果一致;系列大黄酸衍生物对CNE1-RAC1-Luc2细胞萤光素酶活性的调控作用与Western blot结果基本一致。结论 成功构建了含RAC1启动子的萤光素酶报告系统的细胞模型,为高通量进行靶向RAC1药物的筛选提供一个实用的平台。

灰葡萄孢菌Rac1基因的生物信息学分析

利用多种不同序列分析软件,基于生物基因组学数据库,对灰葡萄孢菌Rac1基因进行生物信息学分析,以预测BCRac1基因编码产物的理化性质、结构与功能,同时构建Rac1基因同源系统进化树。结果表明:BCRac1基因编码产物由150个氨基酸构成,为亲水性蛋白,没有信号肽,二级结构以α-螺旋与无规则卷曲为主,推测其主要在细胞核中发挥生物学作用。结构功能域分析表明,BCRac1基因编码产物可能主要具有生长因子的功能,对灰葡萄孢菌的激素调节有影响。构建的Rac1基因编码产物系统进化树显示,BCRac1基因与核盘菌、稻瘟病菌、炭疽菌等物种Rac1基因遗传距离较近,具有高度同源性。

携带萤光素酶报告基因细胞筛选靶向RAC1的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物

目的:采用携带RAC1启动子基因片段及萤光素酶报告基因的肺癌细胞株A549-RAC1-Luc2,筛选靶向抑制RAC1表达的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物。方法:运用分子对接软件MOE分析含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物与RAC1结合能力。采用MTT法检测目标化合物对肺癌A549细胞生长活性的抑制作用;以无细胞毒浓度的含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物处理A549-RAC1-Luc2细胞后,采用萤光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞萤光素酶活性变化,Western blotting法检测各组细胞RAC1蛋白的表达水平。结果:合成的系列含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物4A、4B、4H、4L、4C、4D、4E均能抑制肺癌A549细胞增殖,其半数抑制浓度IC50均明显低于先导化合物Rhein(P<0.01);RAC1激活剂PMA和抑制剂NSC23766可调控A549-RAC1-Luc2细胞的萤光素酶活性(P<0.01),含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物4D、4E能抑制细胞萤光素酶活性及RAC1蛋白的表达,且4D、4E处理后A549-RAC1-Luc2细胞中萤光素酶的表达量明显低于使用RAC1抑制剂NSC23766处理的细胞(P<0.01),且与RAC1结合亲和力最强、稳定性最高。结论:含RAC1启动子及萤光素酶报告基因的肺癌细胞模型可筛选靶向RAC1的抑制剂,含氮取代甲酰胺蒽醌修饰物4D、4E可能是潜在的RAC1抑制剂。

T淋巴瘤侵袭诱导基因在卵巢癌细胞株的表达及其意义

目的研究T淋巴瘤侵袭诱导基因1(Tiam1)在卵巢癌侵袭转移方面的作用。方法RT-PCR检测Tiam1和Rac1mRNA的表达;Westernblot法检测Tiam1蛋白质的表达;Boyden小室体外侵袭实验测定癌细胞迁移能力。结果Tiam1mRNA和蛋白质及Rac1mRNA在4株卵巢癌细胞A2780、Caov3、Skov3及SW626中均呈中高度表达;癌细胞平均迁移百分数分别为(27.67±3.2)%、(10±1.0)%、(22.67±2.5)%及(47.67±1.52)%。Tiam1及Rac1表达水平与癌细胞迁移潜能间均呈显著性相关,r分别为0.874和0.814,P=0.003和0.042。结论Tiam1/Rac1信号转导通路在卵巢癌细胞的侵袭和转移过程中起重要作用,为卵巢癌的基因治疗提供了新的靶点。

Twist在宫颈癌细胞株Hela中的表达变化及其对细胞侵袭转移的影响

目的观察扭曲因子Twist在宫颈癌细胞株Hela中的表达变化,并探讨其对Hela细胞侵袭转移的影响以及作用机制。方法取宫颈癌细胞株Hela以及人宫颈永生化上皮细胞H8,采用Western blotting法检测细胞中Twist蛋白。常规培养宫颈癌细胞株Hela,分为对照组、过表达组、沉默组,后两组采用慢病毒转染技术分别过表达和沉默细胞中的Twist基因,采用boyden实验检测细胞侵袭能力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Western blotting法检测Rac1以及MMP-2蛋白。结果 Hela细胞中Twist蛋白表达高于H8细胞(P<0.05)。与对照组相比,过表达组细胞中Twist蛋白表达升高,细胞侵袭、迁移能力增强,Rac1、MMP-2蛋白表达增加(P均<0.05);与对照组相比,沉默组细胞中Twist蛋白表达降低,细胞侵袭、迁移能力减弱,Rac1、MMP-2蛋白表达降低(P均<0.05)。结论 Twist在宫颈癌细胞株Hela中高表达,促进/抑制其表达可以显著增强/降低Hela的侵袭转移,机制可能是通过作用于侵袭转移相关蛋白Rac1、MMP-2的表达进而调控细胞的侵袭转移。

Rac1基因多态性在湖北汉族肾移植患者中的分布

目的研究Rac1基因中7个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点在湖北汉族肾移植患者中的分布特点,为探讨Rac1基因多态性与肾移植患者使用嘌呤类药物效应的关联性提供依据。方法应用实时荧光Taq Man-MGB探针等位基因分型技术,对湖北汉族194例肾移植患者和200例健康人群的Rac1基因7个单核苷酸多态性位点的基因型进行分析,并对2种人群间的基因型与等位基因进行比较。结果 Rac1基因上所选的7个单核苷酸多态性位点均符合HardyWeinberg平衡,其中rs702482与rs836488,rs10951982与rs9374位点间存在高度连锁不平衡;筛选出5个标签单核苷酸多态性:rs836488、rs9374、rs6954996、rs12977、rs702483。结论 Rac1基因7个单核苷酸多态性位点的基因型及等位基因的分布,在肾移植患者和健康人群间无显著性差异。性别对基因型及等位基因的分布影响在统计学上无差异。

Rac1基因真核表达质粒的构建及其对结肠癌细胞生物学功能的影响

目的应用分子生物学技术构建Rac1基因真核表达质粒及小分子RNA(siRNA)干扰片段,通过调控其表达,研究Rac1蛋白对结肠癌细胞生物学功能的影响。方法从结肠癌细胞中扩增Rac1基因,构建pCDNA3.1(+)-Rac1和pEGFP-Rac1真核表达质粒实现过表达Rac1基因;通过小分子RNA干扰抑制Rac1基因表达。利用侵袭实验、划痕实验研究Rac1基因对结肠癌细胞侵袭和迁移能力的改变;通过Pull-Down实验,研究调控Rac1表达对癌细胞中GTPase活性的影响。结果成功构建Rac1基因真核表达质粒。通过调控Rac1蛋白的表达证实其与结肠癌细胞中Rac1GTPase的活化程度,以及肿瘤细胞的迁移和侵袭能力呈正性关联。结论通过抑制Rac1的表达,可以有效阻止Rac1 GTPase的激活,从而抑制肿瘤细胞的迁移及侵袭,为抑制结肠癌进展提供新的干预靶点,也为进一步免疫生物过继治疗提供了必要的实验基础。

环状RNA circWHSC1在结肠癌的表达及相关分子机制研究

目的探讨环状RNAcircWHSC1在结肠癌发生发展过程中的作用及其相关分子机制。方法选取2017-01-01-2021-01-31郑州人民医院病理确诊为结肠癌的60例患者癌及癌旁组织(距癌旁≥5cm),按照circWHSC1表达水平将患者分为高表达组(≥3.44,33例)与低表达组(<3.44,27例)。Kaplan-Meier plotter法分析circWHSC1表达与患者预后生存的关联性。通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测circWHSC1、miR-142-3p和RAC1的表达;采用蛋白质印迹法、CCK-8和Transwell检测其蛋白的表达、细胞的增殖和转移能力;双荧光素酶报告基因和RT-PCR验证circWHSC1、miR-142-3p和RAC1三者之间的作用关系。结果circWHSC1在结肠癌患者癌组织(3.74±1.60)中的表达高于癌旁组织(1.07±0.58),t=7.572,P<0.001;与circWHSC1低表达组相比,circWHSC1高表达组结肠癌患者的生存时间缩短,χ^(2)=12.321,P<0.001。结肠癌细胞系HCT116的circWHSC1表达量最高,F=29.380,P<0.001。敲低circWHSC1可抑制HCT116细胞的增殖(t=12.775,P<0.001)、迁移(t=46.973,P<0.001)和侵袭能力(t=40.935,P<0.001)。双荧光素酶报告基因显示,circWHSC1与miR-142-3p具有靶向关系,而敲低circWHSC1可增加HCT116细胞中miR-142-3p表达水平,t=17.705,P<0.001。在敲低circWHSC1基础上应用miR-142-3p抑制剂则可以增强HCT116细胞的增殖(t=7.304,P=0.002)、迁移(t=16.049,P<0.001)和侵袭能力(t=14.994,P<0.001)。miR-142-3p在结肠癌患者癌组织中的表达低于癌旁组织,t=12.599,P<0.001。双荧光素酶报告基因实验证实,RAC1为miR-142-3p的靶基因,过表达miR-142-3p可抑制HCT116细胞中RAC1蛋白表达水平(t=25.162,P<0.001),并且发现,在敲低circWHSC1基础上过表达RAC1同样可以增强HCT116细胞的增殖(t=7.658,P=0.002)、迁移(t=62.626,P<0.001)和侵袭能力(t=58.596,P<0.001)。RAC1在结肠癌患者癌组织中的表达同样高于癌旁组织(t=14.873,P<0.001),敲低circWHSC1可在抑制HCT116细胞中RAC1表达的同时,抑制其下游PAK1蛋白RAC1、PAK1及p-PAK1的表达和激活,t值分别为7.506、15.588和6.795,P值分别为0.001、<0.001和0.002。结论circWHSC1可能通过调控miR-142-3p/RAC1/PAK1轴参与结肠癌的发生过程,为未来临床结肠癌早期诊断和治疗提供新的靶点。