甜菜夜蛾泛素延伸蛋白基因cDNA的3′RACE-PCR扩增及其克隆和表达

根据已知的草地夜蛾Spodopterafrugiperda的泛素延伸基因 5′端核苷酸序列设计引物 ,应用 3′RACE PCR技术 ,从甜菜夜蛾S .exigua脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素基因的cDNA片段。扩增得到的片段全长 5 13bp ,3′末端有 12 3bp的非翻译区 ,翻译区编码一个长为 12 9个氨基酸残基的蛋白质 ,预测分子量为 14 8kD。同源分析表明 ,此cDNA序列为ubiquitin 5 3aaextensionprotein(ubi 5 3)基因 ,在泛素蛋白后融合了一个核糖体L4 0蛋白 (ribosomalL4 0protein)。用MagAlign和Genedoc软件对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析 ,结果表明 :甜菜夜蛾的ubi 5 3基因与真核生物家蚕Bombyxmori、草地夜蛾、果蝇Drosophilamelanogaster和人Homosapienes泛素的同源性分别为 96 9%、98 5 %、95 3%和 93 0 % ,与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)泛素的同源性为 78 8% ,说明真核生物的泛素基因与核型多角体病毒的泛素基因可能存在不同的分子进化途径。将甜菜夜蛾的ubi 5 3基因克隆到原核表达载体pET 2 8a上 ,转化至BL2 1(DE3)中 ,用IPTG进行诱导表达 ,用异源泛素单克隆抗体进行Westernblot检测 。

Race法扩增4株鸭肝炎病毒3′末端序列及其克隆分析

利用3’RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒（DHV）（ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株）的基因组的3’末端真实序列，包括部分非结构蛋白（3D）基因以及紧接着3D基因下游的3’端非编码区（untranslated region，UTR）和poly（A）尾巴。测序结果表明，扩增的特异性片段长度为597nt（不包括polyA尾巴）。各毒株3’UTR均为315nt，位于终止密码子TGA之后，比对分析结果表明各毒株间的同源性较高；4株DHV 3’末端核苷酸序列（不包括polyA尾巴）之间的同源性为96．3％～100％，而与参考毒株之间的同源性为93．5％～99．7％。在系统发生进化树上，各毒株亲缘关系较近。

运用3′RACE验证LongSAGE文库构建后白念珠菌不同菌相的差异表达基因

目的 鉴定从LongSAGE文库筛选到的白念珠菌不同菌相表达基因差异表达标签JMD8和JSW10所代表基因。方法 诱导白念珠菌菌丝相的表达后,运用3′RACE技术扩增白念珠菌差异表达基因标签基因片段,纯化回收后,T/A连接,经氯化钙法转化大肠杆菌,X gal/IPTG诱导表达,在阳性菌株中抽提质粒后酶切、测序。结果 两个片段均能在GenBank中找到同源序列,Score值小于40 ,Evalue小于0 5。结论 鉴定了白念珠菌LongSAGE标签JMD8和JSW 10代表的基因分别为EFT2和SHMII。

褐飞虱Nilaparvata lugens(S"非汉字符号"l)肌动蛋白基因3′-RACE及基因表达的RT-PCR检测

通过锚定的 3′ RACE筛选实验 ,确定锚定效率最好的下游引物 ,用于褐飞虱各发育期肌动蛋白基因表达的RT PCR检测。结果表明 :3个锚定引物中 ,0 4 2 2 7( 5′ >TCACACAGGAAACAGCTATGACTTTTTTTTTTTTTTA <3′)的锚定效率最好 ,可以扩增出 5条褐飞虱的肌动蛋白基因 3′末端片段 ,依其大小命名为BPH A、BPH B、BPH C、BPH D、BPH E。RT PCR检测表明 :BPH A从 3龄开始到成虫期都有常量表达 ;BPH B、BPH C、BPH E从 2龄开始到成虫期都有表达 ;BPH D在整个幼虫期都有表达 。

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。

应用3’RACE技术扩增仿刺参C型凝集素基因及实验条件的优化

从GenBank上调取刺参C型凝集素(C-type Lectin)基因序列EST,根据此序列设计RACE引物,采用PCR扩增技术得到了仿刺参C-type Lectin基因序列(EST),根据这段EST序列设计1个基因特异引物(GSPF),与通用引物(UPM)扩增,成功地克隆到了该基因的3’末端序列.同时,对仿刺参C型凝集素基因3’克隆的实验条件进行了优化.该扩增片段长度为670bp,与已知序列重叠部分为417bp.经测序和比对发现该段序列与预期的目标基因的序列一致.

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。

应用RACE技术扩增驴DGAT1基因3′端及序列分析

DGAT1(脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶)基因是产奶性状的一个重要功能侯选基因。由于通过预测奶牛DGAT1基因序列与马属动物DGAT1基因序列具有98%的同源性,本试验从影响牛产奶性状的DGAT1基因出发,以驴乳腺组织的RNA为模板,按照不同物种DGAT1基因的相似性设计特异引物,运用PCR和3′RACE技术扩增并获得了特异片断,特异片段回收纯化连接到pUCmT Vector载体后,转化到大肠杆菌中并筛选阳性菌落;提取质粒进行测序,结果发现该段序列与预期的目标一致,通过与其他动物同源性比较分析说明已首次克隆到驴DGAT1基因3′端。

一株诺如病毒的3’RACE扩增及基因序列分析

诺如病毒是严重危害人类健康的重要食源性病原。作者应用3’RACE(rapid amplification of cDNA 3’ends)技术对一株诺如病毒分离株的基因组3’末端进行扩增,并对其核苷酸序列进行比较分析,从而可为该病的分子生物学检测提供阳性物质,并从分子水平上推测该病的来源。经过提取病毒总RNA、以3’RACE锚定引物进行反转录、用特异引物进行3’RACE,琼脂糖凝胶电泳检测结果表明成功扩增了诺如病毒基因组约3282 bp的基因片段,测序及序列BLAST分析证实该分离株属GⅡ-4型,与日本分离株同源。3’RACE扩增序列为诺如病毒的实验室检测及深入研究奠定了基础。

基于3'RACE的胃癌细胞肿瘤相关基因的APA位点分析

目的分析胃癌细胞中肿瘤相关基因的APA(alternative polyadenylation)位点变化。方法我们选取肿瘤相关基因HSP90α和SEC11A,利用3'RACE方法在胃癌细胞系MKN45、MKN28和AGS中扩增其mRNA的3'端序列,经过测序,与已知数据库UCSC比对分析其APA位点变化。结果与正常数据库相比,胃癌细胞中HSP90α和SEC11A两个基因均出现新的APA位点,产生含有不同长度的3'UTR(untranslated region)的新mRNA异构体。结论胃癌细胞中HSP90α和SEC11A的APA位点发生变化,产生新的mRNA异构体,为研究肿瘤发生发展提供了新思路。

3′RACE法扩增谷氨酰胺合成酶基因及其生物信息学分析

以抽提得到的黑曲霉mRNA为模板,根据GenBank上检索的谷氨酰胺合成酶基因mRNA序列,设计特异性引物,进行3′RACE PCR扩增,并在NCBI网站进行生物信息学分析。结果扩增得到长约1kb的DNA片段,测序结果表明,所获得的DNA序列与gene bank上检索到黑曲霉产谷氨酰胺合成酶基因的同源性大于97%,与其他曲霉产谷氨酰胺合成酶的基因同源性大于50%。经开放阅读框软件分析发现其具有2个外显子,其中1个外显子的氨基酸序列与黑曲霉产GS同源性为100%。

RACE技术对薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的快速扩增

对微生物Absidia sp.G3d产薯蓣皂苷糖苷酶基因cDNA3′末端的序列进行了调取。根据薯蓣皂苷糖苷酶基因的CDS区已知序列设计特异性引物,应用3′RACE(Rapid-Amplification of cDNA 3′Ends)技术,快速扩增得到cDNA 3′端未知序列片段,将PCR产物切胶回收,直接测序得到长度为258 bp的产物序列,经比对其中编码区长度为122 bp,非编码区长度为136 bp,Poly A部分长度为28 bp。这对其他类中草药高活性皂苷糖基水解酶基因cDNA3′末端的序列的调取提供了参考。

从LongSAGE标签获取cDNA长片段的3'-RACE方法的建立

长标签基因表达系列分析和末端快速扩增都是目前人类基因组研究中的重要方法.该文介绍了一种我们改良以后的末端快速扩增方法(3'-RACE),用于从LongSAGE标签扩增基因3'端序列.实验证明该方法技术稳定、重复性好,所获得的3'端cDNA纯度高、完整性好,表明该方法切实可行.

鸭肝炎病毒基因组3′末端序列的克隆和分析

用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′UTR,而poly（A）尾分别含18个A和19个A。由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员。两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%-37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围（18%-60%）之内;此外,Ⅰ型DHV的3′UTR在小RNA病毒科是最长的。用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属。

大豆疫霉根腐病菌的分离鉴定及种质资源对3号生理小种的抗性评价

采用下胚轴伤口接种法,用在黑龙江省建三江农场分离到的大豆疫霉菌3号生理小种对292份栽培大豆材料(其中农家品种153份、其它大豆栽培品种139份)和236份野生大豆材料进行了抗性鉴定。结果表明:栽培大豆资源抗病80份,占27.4%,中间类型93份,占31.8%,感病119份,占40.8%。153份农家品种中,抗病的有49份,占农家品种的32.0%,表明农家大豆品种资源抗性比例较高。野生大豆资源中抗病的有49份,占20.8%;中间类型55份,占23.3%;感病132份,占55.9%。鉴定的这些高抗资源可为我国大豆抗疫霉根腐病育种奠定基础。

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列。该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1373bp,与已知NHX1序列同源性最大为80%,其编码区1094bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)长度为239 bp。3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97%、45.63%和40.64%,明显低于编码区的同源性。结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础。

五寨黑豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性遗传分析

大豆胞囊线虫3号生理小种是东北大豆产区分布最广、危害最大的生理小种,五寨黑豆对包括大豆胞囊线虫3号生理小种在内的7个生理小种具有高抗性。以黑龙江省主栽品种合丰35为母本,与五寨黑豆进行杂交,通过鉴定F_2、F_3代对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性,研究了五寨黑豆对大豆胞囊线虫抗性遗传。结果表明:在以合丰35为遗传背景下,五寨黑豆对SCN 3号生理小种的抗、感分离比例符合孟德尔遗传规律中1∶3的分离比例,表明五寨黑豆对SCN 3号生理小种的抗性是由1对隐性基因控制。

富有柿果实ACC合成酶3′末端的cDNA克隆

利用3′RACE的方法对柿果实ACC合成酶基因的3′末端进行扩增,扩增产物克隆到pMD18-T Vector载体上,转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α,蓝白斑筛选重组质粒,并对插入片段进行序列测定。结果表明,3′RACE产物长912 bp,开放阅读框内核苷酸序列编码251个氨基酸,此氨基酸序列含有ACC合成酶中3个高度保守区,GenBank中登录的DK-ACS1(登录号AB073005)序列只有一个的氨基酸不同。终止子后面的3′非编码区的长度为155 bp,其中只有一个核苷酸与DK-ACS1的3′序列非编码区不同。序列分析结果显示,克隆的片段含有5′端GSP Inner Primer和3′端为RACE Inner Primer的引物。

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列RACE扩增方法的建立

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 cDNA的3′末端序列;采用反向嵌套PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列,设计了1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1cDNA的5′末端序列。结果显示,获得了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因的全序列。证实,RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。

猪嵴病毒441株3D基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR技术及3'RACE法扩增猪嵴病毒441株(swKoV CH441株)3D基因。成功扩增了swKoV CH441株的3D基因,3'非编码区(3'untranslated region,3'UTR)及Poly(A),扩增的基因片段长度分别为1 064、1 046和592 bp,包括3A、3B、3C、3D基因序列,3'UTR序列和一个至少含有29个Poly(A)的尾巴。序列分析结果表明,swKoV CH441株3D基因全长1 407 bp,编码468个氨基酸,分子质量约为53 369.29 D,理论等电点为6.12;3'UTR位于终止密码子TGA之后,长166 bp;swKoV CH441株与其他猪嵴病毒3D基因核苷酸序列相似性在92.2%-93.4%,氨基酸一致性为97.9%-99.4%。遗传进化分析表明,swKoV CH441株与国内株亲缘关系较近,与匈牙利株亲缘关系较远。