甜菜夜蛾泛素延伸蛋白基因cDNA的3′RACE-PCR扩增及其克隆和表达

根据已知的草地夜蛾Spodopterafrugiperda的泛素延伸基因 5′端核苷酸序列设计引物 ,应用 3′RACE PCR技术 ,从甜菜夜蛾S .exigua脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素基因的cDNA片段。扩增得到的片段全长 5 13bp ,3′末端有 12 3bp的非翻译区 ,翻译区编码一个长为 12 9个氨基酸残基的蛋白质 ,预测分子量为 14 8kD。同源分析表明 ,此cDNA序列为ubiquitin 5 3aaextensionprotein(ubi 5 3)基因 ,在泛素蛋白后融合了一个核糖体L4 0蛋白 (ribosomalL4 0protein)。用MagAlign和Genedoc软件对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析 ,结果表明 :甜菜夜蛾的ubi 5 3基因与真核生物家蚕Bombyxmori、草地夜蛾、果蝇Drosophilamelanogaster和人Homosapienes泛素的同源性分别为 96 9%、98 5 %、95 3%和 93 0 % ,与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)泛素的同源性为 78 8% ,说明真核生物的泛素基因与核型多角体病毒的泛素基因可能存在不同的分子进化途径。将甜菜夜蛾的ubi 5 3基因克隆到原核表达载体pET 2 8a上 ,转化至BL2 1(DE3)中 ,用IPTG进行诱导表达 ,用异源泛素单克隆抗体进行Westernblot检测 。

抗大豆胞囊线虫3号生理小种(SCN3)核心种质代表性分析

大豆胞囊线虫（soybean cyst nematode，SCN）病是大豆生产中最严重的病害，这种病害最好的防治措施就是培育抗性品种。然而，中国大多数大豆育成品种都不抗SCN3。为了有效的研究和利用中国的大豆抗胞囊线虫种质资源，将64份中国小黑豆品种（包括鉴别寄主）对现有的1、2、3、4、5、7、14号7个大豆胞囊线虫（Heterodera glycirtes）生理小种进行了抗性鉴定，应用SPSS统计系统软件将供试品种的抗病基因进行分类；同时调查了在田间根部感染SCN3的胞囊数量。结果表明：在相似距离为0．52时，将供试64个品种按含有抗感大豆胞囊线虫生理小种的抗性基因差异，可以划分为7大类。在田间连续5年（2003～2007）跟踪调查不同大豆根部侵染的胞囊量情况，平均胞囊量为0的有应县小黑豆等共18个品种；平均胞囊量为0．07的有哈尔滨小黑豆等共8个品种；平均胞囊量为0．13的有平顶山和茶豆；其它各品种的平均胞囊量均在0．13～6．00之间。综合上述试验结果以及各品种的农艺性状，选用等比例取样法构建了由16份种质资源组成的抗SCN3初选核心种质。抗SCN3初选核心种质的建立，为深入了解中国大豆抗性种质的遗传多样性、研究SCN3复杂抗性遗传变异规律和发掘新基因提供了合理的样本，同时将有助于加速抗病育种的进程，满足生产上的需要。

Race法扩增4株鸭肝炎病毒3′末端序列及其克隆分析

利用3’RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒（DHV）（ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株）的基因组的3’末端真实序列，包括部分非结构蛋白（3D）基因以及紧接着3D基因下游的3’端非编码区（untranslated region，UTR）和poly（A）尾巴。测序结果表明，扩增的特异性片段长度为597nt（不包括polyA尾巴）。各毒株3’UTR均为315nt，位于终止密码子TGA之后，比对分析结果表明各毒株间的同源性较高；4株DHV 3’末端核苷酸序列（不包括polyA尾巴）之间的同源性为96．3％～100％，而与参考毒株之间的同源性为93．5％～99．7％。在系统发生进化树上，各毒株亲缘关系较近。

SCN1A基因突变阴性热性惊厥患者SCN3A基因突变的特点

目的对SCN1A基因突变阴性的热性惊厥(FS)患者进行SCN3A基因突变筛查,并分析其突变特点。方法应用聚合酶链反应扩增和Sanger测序方法对38例入组患者筛查SCN3A基因突变,采用生物软件分析突变特点。结果 2例错义突变(c.956T>C/p.I319T,c.5179G>A/p.D1727N);同源性比对分析提示2例突变均高度保守,在千人基因组计划数据库和100例正常人中未发现相应的位点改变。结论在SCN1A基因突变阴性的FS患者中,发现2例SCN3A基因突变错义突变,该突变可能具有致病性。

运用3′RACE验证LongSAGE文库构建后白念珠菌不同菌相的差异表达基因

目的 鉴定从LongSAGE文库筛选到的白念珠菌不同菌相表达基因差异表达标签JMD8和JSW10所代表基因。方法 诱导白念珠菌菌丝相的表达后,运用3′RACE技术扩增白念珠菌差异表达基因标签基因片段,纯化回收后,T/A连接,经氯化钙法转化大肠杆菌,X gal/IPTG诱导表达,在阳性菌株中抽提质粒后酶切、测序。结果 两个片段均能在GenBank中找到同源序列,Score值小于40 ,Evalue小于0 5。结论 鉴定了白念珠菌LongSAGE标签JMD8和JSW 10代表的基因分别为EFT2和SHMII。

用3′RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3′末端序列

应用 3′RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒 ( FMDV) OH99株基因组 3′端真实序列。测序结果表明 ,所扩增的目的基因片段长 15 0 0 nt,包括 3D基因部分序列、3′端非编码区 ( Non- Coding Region,NCR)和 Poly( A)尾巴 ,其中 3′NCR位于终止密码子 TAA之后 ,长 93nt,Poly( A)尾序列至少含有 5 6个 A。与参考毒株进行序列比较 ,结果显示 ,OH99株与 OTY TW/ 97株的核苷酸同源性较高 ,为 91.4 % ,而与 O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低 ,其同源性分别为 6 8.1%、71.0 %、70 .2 %。 3′NCR的末端存在保守性较高的基序 :CCCTCAGATG,TTTTCCC-CGCTTCCT。本研究为进一步研究 FMDV基因组的功能、构建 OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。

褐飞虱Nilaparvata lugens(S"非汉字符号"l)肌动蛋白基因3′-RACE及基因表达的RT-PCR检测

通过锚定的 3′ RACE筛选实验 ,确定锚定效率最好的下游引物 ,用于褐飞虱各发育期肌动蛋白基因表达的RT PCR检测。结果表明 :3个锚定引物中 ,0 4 2 2 7( 5′ >TCACACAGGAAACAGCTATGACTTTTTTTTTTTTTTA <3′)的锚定效率最好 ,可以扩增出 5条褐飞虱的肌动蛋白基因 3′末端片段 ,依其大小命名为BPH A、BPH B、BPH C、BPH D、BPH E。RT PCR检测表明 :BPH A从 3龄开始到成虫期都有常量表达 ;BPH B、BPH C、BPH E从 2龄开始到成虫期都有表达 ;BPH D在整个幼虫期都有表达 。

应用RACE技术扩增驴DGAT1基因3′端及序列分析

DGAT1(脂酰辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶)基因是产奶性状的一个重要功能侯选基因。由于通过预测奶牛DGAT1基因序列与马属动物DGAT1基因序列具有98%的同源性,本试验从影响牛产奶性状的DGAT1基因出发,以驴乳腺组织的RNA为模板,按照不同物种DGAT1基因的相似性设计特异引物,运用PCR和3′RACE技术扩增并获得了特异片断,特异片段回收纯化连接到pUCmT Vector载体后,转化到大肠杆菌中并筛选阳性菌落;提取质粒进行测序,结果发现该段序列与预期的目标一致,通过与其他动物同源性比较分析说明已首次克隆到驴DGAT1基因3′端。

应用3’RACE技术扩增仿刺参C型凝集素基因及实验条件的优化

从GenBank上调取刺参C型凝集素(C-type Lectin)基因序列EST,根据此序列设计RACE引物,采用PCR扩增技术得到了仿刺参C-type Lectin基因序列(EST),根据这段EST序列设计1个基因特异引物(GSPF),与通用引物(UPM)扩增,成功地克隆到了该基因的3’末端序列.同时,对仿刺参C型凝集素基因3’克隆的实验条件进行了优化.该扩增片段长度为670bp,与已知序列重叠部分为417bp.经测序和比对发现该段序列与预期的目标基因的序列一致.

大豆抗SMV_1、SCN_3基因聚合选择方法的研究

采用抗大豆孢囊线虫 3号生理小种SCN3 和大豆花叶病毒 1号株系SMV1的大豆品种互交 ,F1F5用 5种不同选择方法 ,产量LSD 0 .0 5测定处理间表现为A、B、C三个等级 ;不同选择方法的 6个产量性状变异系数差距大。SCN3 和SMV1双抗性基因RSVRSN互作对产量具有累加增产效应达 8% 35 .9% ,品系产量和品系抗性基因聚合数量呈极显著正相关 (r=0 .972 )。不同选择方法F5RSVRSN出现率 0 % 10 0 %。双接种法或交叉接种法F5RSVRSN出现率 10 0 % ,株系间变异大 ,结合异季南繁加代 。

人及小鼠钠通道SCN3A基因的启动子及其上游调控区的分析

为了比较研究人与小鼠SCN3A基因的启动子及其上游调控区的特征,采用5′-FullRACE方法对人及小鼠SCN3A基因的转录起始点进行了准确定位,通过序列测定及对比分析证明:确定人和小鼠SCN3A基因的转录起始点均为"A",人SCN3A基因转录起始点位于翻译起始点上游约27kb处,而小鼠位于翻译起始点上游约31kb处.人SCN3A基因5′非翻译区存在两个5′非翻译外显子,而小鼠只有一个5′非翻译外显子.人和小鼠SCN3A基因核心启动子区(-80～+70)的同源率高达96.0%,存在相同的启动子核心元件,BRE/和TATA;在-400至+200区段内预测到人存在而小鼠不存在的转录因子有PHR1、GATA-1、FOXN2、NF-1及AP-4,小鼠存在而人不存在的转录因子Sp、Sp3及GBF.人和小鼠SCN3A启动子区特征的异同将为进一步研究该基因在人和小鼠的表达调控机制提供重要线索.

三维配位聚合物[Co(pda)(SCN)(H_2O)]_n[pda=3-(3-吡啶基)丙烯酸]的合成和晶体结构

以CoCL_2、3-(3-吡啶基)丙烯酸(pda)和KSCN为原料,在水热反应条件下,合成了一种三维配位聚合物[Co(pda)(SCN)(H_2O)_n]晶体,对其进行了元素分析、红外光谱表征、X射线单晶衍射测定和热重分析。该配位聚合物属三斜晶系,P-1空间群,晶胞参数为a=0.7309(5)nm,b=0.8799(6)nm,c=0.9634(6)nm,α=68.128(10)°,β=73.241(11)°,γ=71.218(12)°,V=0.5343(6)nm^3,Z=2,d_c=1.760g/cm^3,μ=1.792mm^(-1),F(000)=268,R1=0.0450,wR2=0.1035。X射线单晶衍射显示形成一个三维的网络结构。

在NaNO_3存在下浮选CuSCN间接测定抗坏血酸

建立了浮选CuSCN间接测定抗坏血酸（Vc）的方法。研究表明,在NaNO3存在下,Cu（Ⅱ）被抗坏血酸还原生成的Cu（Ⅰ）与SCN^-形成CuSCN沉淀而被浮选。结果表明,Vc量在2.64-15.8 mg/L范围内与CuSCN的浮选率呈良好的线性关系,回归方程为：E/%=6.008ρ-3.673,r=0.9962。此方法可用于水果和药片中Vc量测定。

丙戊酸钠对SCN3A基因表达的抑制作用

目的:研究丙戊酸钠在Nav1.3通道基因表达中的作用,为癫痫的临床治疗提供新的依据。方法:通过用丙戊酸钠对N1E-115细胞进行处理,检测丙戊酸钠处理后N1E-115细胞的SCN3A mRNA水平;把SCN3A基因启动子构建成表达载体,转染到N1E-115细胞中,再用丙戊酸钠对转染质粒的细胞进行处理,检测SCN3A mRNA的水平及萤火虫荧光素酶的表达水平。结果:丙戊酸钠对SCN3A具有明显的抑制作用,丙戊酸钠能抑制SCN3A的表达,降低SCN3A蛋白的表达水平。结论:丙戊酸钠通过降低SCN3A的表达达到抑制癫痫发作的作用,开启了对丙戊酸钠治疗癫痫机制的新认识。

用RACE技术快速扩增五指山猪来源的猪内源性反转录病毒3'LTR

测定我国小型猪来源的猪内源性反转录病毒(PERV)3'LTR,以便于PERV全基因的克隆和分析。用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,从五指山猪外周血淋巴细胞mRNA中扩增到PERV-3'LTR,并克隆入pGEM-Teasy载体,将阳性克隆进行序列测定和同源性分析。测序结果显示该克隆3'端的尾部有一个由12个A组成的poly(A)信号;其R区与PERV-MSL的R区(约64bp)基本一致,同源性分析表明其与PERV-MSL的3'LTR具有81%的序列同源性。说明成功扩增了我国五指山猪来源的PERV-3'LTR,将有利于PERV全基因的克隆。

高油抗SCN3大豆新品种齐农3号的选育及栽培技术要点

齐农3号是黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院于2005年以合03-149为母本,丰豆1号为父本,进行有性杂交选育而成的高油抗线大豆新品种。该品种适应性广,稳产丰产性好,2年区域试验11点次试验全部增产,平均产量2622.6kg·hm^-2,较对照品种嫩丰18增产13.4%,一年生产试验,6点次试验全部增产,平均产量2627.6kg·hm^-2,较对照品种嫩丰18增产13.4%.

一株诺如病毒的3’RACE扩增及基因序列分析

诺如病毒是严重危害人类健康的重要食源性病原。作者应用3’RACE(rapid amplification of cDNA 3’ends)技术对一株诺如病毒分离株的基因组3’末端进行扩增,并对其核苷酸序列进行比较分析,从而可为该病的分子生物学检测提供阳性物质,并从分子水平上推测该病的来源。经过提取病毒总RNA、以3’RACE锚定引物进行反转录、用特异引物进行3’RACE,琼脂糖凝胶电泳检测结果表明成功扩增了诺如病毒基因组约3282 bp的基因片段,测序及序列BLAST分析证实该分离株属GⅡ-4型,与日本分离株同源。3’RACE扩增序列为诺如病毒的实验室检测及深入研究奠定了基础。

Titin蛋白基因3′UTR单核苷酸多态性分析和RACE扩增

本文以6头纯种长白猪、6头蓝塘猪和243头F2代杂交猪个体为对象,采用RACE方法扩增3′非翻译区序列,运用单核苷酸多态性(SNPs)技术分析Titin基因3′非翻译区的多态性。结果显示:3′非翻译区延展出236个碱基新序列;SNPs检测到F2代群体有三种基因型,两种纯合子(AA型和BB型)和一种杂合子(AB型);测序结果显示Titin蛋白基因3′UTR+317位为A→G单碱基变化。

SCN3A基因突变型表达载体的构建及在HEK 293细胞中的表达

目的体外构建含有SCN3A基因mRNA片段的质粒pCMV_6-XL_4-SCN3A的突变体N302S(c.905A>G),为进一步的功能研究奠定实验基础。方法设计带突变位点的引物,以野生型质粒为模板进行定点诱变,构建突变质粒。质粒经扩增纯化后瞬时转染到HEK293细胞中,24 h后用RT-PCR方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定及测序证实突变成功。突变质粒转入HEK293细胞系24 h后,RT-PCR可以检测到目的基因的表达。结论本实验成功地构建了SCN3A基因突变型真核表达载体pCMV_6-XL_4-SCN3A-N302S,并在基因水平上验证了能在HEK293细胞中表达。