青花菜BrERF2基因的RACE克隆与模拟酸雨胁迫下的表达分析

为探讨青花菜在模拟酸雨胁迫下ERF基因的表达变化,应用RACE克隆技术,克隆获得青花菜的ERF因的1条c DNA全长序列,命名为Br ERF2。应用生物信息学方法,对该基因编码蛋白的氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、信号肽导肽、疏水性/亲水性、二级结构、亚细胞定位、保守结构域等方面进行了预测和分析。结果表明:获得c DNA全长为958 bp,开放阅读框为804 bp,编码267个氨基酸,Real-time PCR结果分析表明模拟酸雨胁迫下Br ERF2基因的表达量发生变化,模拟酸雨胁迫初期表达量显著增大,随时间延长,又开始下降,表明其可能参与了青花菜抗酸雨胁迫的应答机制。本研究为青花菜的抗酸雨胁迫研究奠定了基础。

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。

全长cDNA的获得──RACE及其他方法进展

全长cDNA的获得是基因克隆的重要内容，也是基因组研究的重要内容之一。cDNA末端快速扩增技术（RACE）是获得全长cDNA的主要辅助手段之一，本文对RACE技术的原理、改进和近几年发展起来的新型RACE（包括RNA连接酶介导的RACE、oligo－capping等）作了综述。同时，对用干全长CDNA克隆的其他技术，如引物载体法、固相支持物法作了介绍。

浙贝母环阿屯醇合成酶基因5`-RACE快速扩增及序列分析

[目的]克隆浙贝母环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)5`末端cDNA序列。[方法]利用简并引物及RT-PCR方法获得CAS的核心基因,应用cDNA末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术快速克隆5`末端片段,采用NCBI网站上的Protein Blast软件进行氨基酸同源性比对。[结果]从浙贝母叶片中成功地克隆出一条长691bp的CAS基因5`末端cDNA片段,含起始密码子及163bp的5`延伸区。对5`末端的150个氨基酸同源性分析表明,该片段与C.asiatica,G.glabra,A.thaliana,W.somnifera的CAS同源性分别达72%,66%,71%,71%。[结论]上述结果表明所克隆的片段为浙贝母CAS的5`末端序列,为下一步CAS全长基因的克隆及CAS在浙贝母次生代谢中的功能研究打下基础。

用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3′端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。

常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ ) 转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物 (F1,R1) ,扩增出 4 90bp的特异片段 .然后根据RACE法原理 ,巧妙地设计 3′RACE(F2 )和 5′RACE(R3)特异性引物 ,使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和 5′末端序列 ,又能使扩增出的 3′RACE和 5′RACE产物序列有重叠部分 ;另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对 ,从而能对 3′RACE和 5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定 .该方案不但能够直接根据序列鉴定 3′RACE和 5′RACE产物是否为同一基因序列 ,还能快捷地用常规PCR鉴定 3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增 ,避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程 ,优化了基因克隆策略 .最后根据拼读出的全长序列设计引物 (F4 ,R4 )扩增出完整编码区 .应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ ) 转运蛋白基因的cDNA .

花斑裸鲤MSTN-1基因克隆及表达特性分析

花斑裸鲤是黄河上游重要的冷水性土著鱼类,其生长、发育缓慢,性成熟又较晚,故多年来其种群一直呈下降趋势。MSTN(肌肉生长抑制素)是一种对肌肉生长具有负调控作用的因子,通过克隆花斑裸鲤MSTN-1基因并检测其表达特性,为花斑裸鲤生长缓慢的分子调控机理提供基础资料。采用PCR、5′-RACE和3′-RACE法获得花斑裸鲤MSTN-1基因全长cDNA序列,采用qPCR检测MSTN-1基因在花斑裸鲤不同组织的表达特征和在不同鲤科鱼类肌肉组织中的差异性表达。花斑裸鲤MSTN-1基因的cDNA序列全长为2190 bp,其中ORF长1128 bp,5′UTR长96 bp,3′UTR长966 bp,共编码375个氨基酸。该蛋白是带有一个信号肽、无跨膜结构的不稳定亲水性分泌蛋白,主要分布在细胞核、线粒体和细胞质中。MSTN-1蛋白质二级结构以无规卷曲为主,存在2个TGF-β结构域:即TGF-β前肽区域(37—268 aa)和TGF-β功能区域(281—375 aa),有1个蛋白酶水解位点RIRR和9个位于TGF-β功能区域保守的半胱氨酸残基。氨基酸序列同源性分析表明,花斑裸鲤MSTN-1氨基酸序列与其他鲤科鱼类MSTN-1具有较高的相似性,而与禽类和哺乳动物的相似性较低。系统发育分析显示,花斑裸鲤MSTN-1与其他鲤科鱼类聚于同一进化支。qPCR检测结果表明,MSTN-1在花斑裸鲤的脑、肌肉、鳃、心、肝脏和肾脏组织中均有表达,但在脑和肌肉组织中表达量较高。该基因在不同鲤科鱼类肌肉组织中均有表达,在青海湖裸鲤肌肉组织中的表达量最高,其次在花斑裸鲤和黄河鲤鱼肌肉组织中。通过克隆获得花斑裸鲤MSTN-1基因cDNA序列,进行生物信息学分析和qPCR检测,MSTN-1在这几种土著鱼类肌肉组织中的特征性表达差异有助于进一步了解高原鱼类生长缓慢的分子机理。

利用SMART RACE克隆STGA3 cDNA的5′末端

阐述了SMART RACE的原理,克隆了草莓贝壳杉烯氧化酶基因(STGA3)5′端未知序列。所得到的STGA3 cDNA的5′末端共有1 474 bp,其中非编码区共34 bp,编码区1 440 bp,编码氨基酸480个,此序列在NCBI的注册号为:AY462247。它与已克隆到的同源基因拟南芥GA3和南瓜CYPT01A1之间的同源性分别为56.9%和59.2%。

利用RACE方法克隆小麦β-1，3-葡聚糖酶基因的全长cDNA

【目的】研究小麦抗条锈菌的分子机制,在受条锈菌侵染的非亲和组合小麦叶片中克隆一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA。【方法】采用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(RACE),在感染小麦条锈菌的小麦(水源11)叶片中进行-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA的扩增。【结果】得到了一个1338 bp-β1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,Genbank上注册号为DQ090946,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与-β1,3-葡聚糖酶基因gi3757681和gi6782375的同源性分别为94.3%和92.1%。该全长cDNA具有完整的编码框,编码334个氨基酸,Genbank上注册号为AAY96422,与-β1,3-葡聚糖酶CAA77085和AAA32958的同源性分别为95.8%和86.7%。【结论】初步推断此全长cDNA是小麦中编码-β1,3-葡聚糖酶的一个新基因。

应用RACE法分离和克隆猪GPX2基因研究

[目的]运用分子生物学技术克隆猪GPX2基因。[方法]以猪十二指肠总RNA为模板，根据人、大鼠、小鼠、牛、狗GPX2基因同源序列分析，设计兼并引物对，采用RT—PCR技术扩增获得了l段330bp的猪GPX2基因序列。根据获得的已知序列分别设计引物，采用3＇-RACE和5＇-RACE技术手段分离、克隆猪GPX2基因。并对所得基因进行基因序列分析。[结果]该试验成功克隆分离了1段长924bp的mRNA序列，该序列包含完整3’-末端，与人、鼠、牛、狗GPX2基因具有较高的序列同源性，并在基因第114～116位置具有编码硒代半胱氨酸残基（Sec）的密码子TGA。[结论]序列分析比对的结果表明克隆的基因就是猪GPX2基因（NCBI GeneBank数据库序列号为DQ98982）。

RACE方法在甘蓝型油菜基因克隆中的应用

将Invirtogen公司开发的一种RACE技术应用于甘蓝型油菜基因家族成员的克隆,克隆了查尔酮异构酶基因家族的全部6个成员和类黄酮3′-羟化酶基因家族的2个成员。应用结果表明:该方法具有低成本、高效率、能克隆全长基因的特点,适合甘蓝型油菜等多倍体物种基因家族成员的克隆。

用RACE结合cDNA文库筛选的方法获取新的锌指蛋白基因

大多数有重要功能的蛋白质都含相应的由保守氨基酸顺序组成的功能结构域。本文首先根据蛋白质功能结构域保守氨基酸序列设计简并引物 ,用PCR方法扩增出基因EST序列 ,再利用改进的快速扩增cDNA末端(RACE)方法从cDNA文库中扩增出基因非同源部位 ,然后以非同源序列为探针 ,筛选cDNA文库。利用此方法成功地从人骨髓cDNA文库中克隆到几个编码锌指蛋白并代表原有EST的新的全长cDNA。这一策略也应适用于筛选编码具有其他序列保守性功能结构域蛋白的基因。

应用RACE法克隆鸽恒定链基因的研究

为比较禽类恒定链的结构和功能,应用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术首次克隆并鉴定了鸽恒定链基因。首先用一对含高度保守的DNA片段的简并引物,从鸽脾细胞RNA扩增部分恒定链片段,接着测序并设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,获得大小为1050bp的全长cDNA。比较核苷酸序列,鸽与鸡的Ii链同源性达到82.8%,而与人等其它动物的同源性则在52.0%以上;其中633bp的开放阅读框编码211个氨基酸残基的前体蛋白。推导和分析氨基酸序列表明,分子结构与鸡恒定链相似,其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。

RACE技术研究进展与展望

近年来,RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,即cDNA末端快速扩增技术,是一种快速扩增cDNA的5′和3′末端的有效方法,在扩增全长cDNA方面得到了广泛的应用。综述了RACE技术的研究进展,总结了优化RACE技术几个关键环节。最后展望了RACE技术的发展。

利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究

首次从木薯中分离克隆出AGPase小亚基的基因5’端cDNA序列,最终为进一步成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的cDNA全长序列提供依据。本研究以木薯作为试验材料,设计锚定引物,并根据木薯AGPase小亚基基因已知序列设计PCR特异引物,利用逆转录引物AUP1反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,通过对三大酶促反应(逆转录反应,TdT加尾,巢式及降落PCR技术)的具体改良,并将其与传统方法进行比较。利用改良后方法,首次成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因5’端cDNA序列。同时,本研究通过对RACE技术的改良与传统方法相比,在操作上更加简单、快速;在序列获得上更加高效;在试验成本上更加低廉。本研究可以高效且快速的成功获得木薯淀粉关键酶AGPase小亚基基因5’端序列,具有一定的实用性及简便性。

RACE法克隆湖羊SPLUNC1基因及序列分析

通过克隆湖羊短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)基因的cDNA序列,为研究其蛋白的结构和功能奠定基础。参照GenBank上牛、山羊的SPLUNC1基因的cDNA序列,设计简并引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,测序后进行拼接,获得湖羊SPLUNC1基因cDNA全长序列,并对序列进行分析。结果表明:克隆的湖羊SPLUNC1基因cDNA序列全长为1 091bp(GenBank登录号KJ749828),其中开放阅读框为768bp,共编码255个氨基酸。构建的氨基酸进化树结果显示湖羊SPLUNC1与预测绵羊的氨基酸同源性最高,山羊次之。

RACE法克隆日本三角涡虫β-actin基因

采用cDNA末端快速扩增法(RACE),以日本三角涡虫cDNA为模板扩增β-肌动蛋白(β-actin)基因,对聚合酶链式反应(PCR)产物进行测序和拼接。经与NCBI核酸数据库进行序列比对,结果表明:产物的cDNA长度为1168 bp,开放阅读框ORF长999 bp,编码332个氨基酸,具有actin蛋白家族典型特征。

利用3'RACE和5'RACE技术克隆日本刺沙蚕中枢神经系统TPH基因全长

目的克隆低等无脊椎环节典型代表动物日本刺沙蚕中枢神经系统色氨酸羟化酶基因全长,为无脊椎动物芳香族氨基酸羟化酶的基因进化研究提供依据。方法应用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术进行色氨酸羟化酶基因序列克隆。结果在日本刺沙蚕中枢神经系统克隆出色氨酸羟化酶基因3'序列和5'序列。结论在低等环节动物日本刺沙蚕中枢神经系统存在独立的色氨酸羟化酶基因,使色氨酸羟化酶和苯丙氨酸羟化酶基因分化的节点向前推进到环节动物。

改良RACE技术克隆板栗短雄花序26S核糖体基因片段

RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术是以RT-PCR为基础,根据部分已知基因序列(如EST),通过cDNA的3′端和5′端快速扩增获取全长cDNA的一种有效方法。本文作者以板栗芽变品种短雄花序为材料,利用改良SMART RACE的技术克隆了板栗(Castanea mollissimaBlume)26S基因5′端未知序列,所得到的cDNA的5′末端共有1 204 bp。序列比对分析显示,该检测的核糖体基因与已知其他物种中的核糖体基因高度同源,它与已克隆到的同源基因橡树和八角枫之间的同源性分别为98%和97%。

应用RACE法克隆雷竹笋PAL基因及序列分析

应用RACE法,克隆获得了雷竹笋PAL基因的全长序列,并对其进行了生物信息学分析。结果表明:雷竹笋PAL基因的开放阅读框长度为2103 bp,共编码701个氨基酸,其中具有1个保守的活性位点Ala-Ser-Gly(A-S-G);在PAL蛋白的二级结构中含有大量的α螺旋和β折叠,其三级结构模型为一个带柄的圆锥形。构建的PAL基因核苷酸序列进化树结果显示雷竹与毛竹、绿竹的亲缘关系最近,与小麦、大麦、水稻、佛肚竹的亲缘关系较近,与玉米、高粱的亲缘关系较远。