养殖刺参腐皮综合征两种致病菌Dot-ELISA快速检测

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征两种主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清,建立了两种病原菌的点酶ELISA(Dot-ELISA)检测方法。根据方正试验,确定检测用一抗、二抗最佳工作稀释度:灿烂弧菌抗血清稀释度320,酶标二抗稀释度3 000;假交替单胞菌抗血清稀释度160,酶标二抗稀释度2 000。阻断试验结果表明两种抗血清特异性均较高。灿烂弧菌抗血清在稀释度为40时与溶藻胶弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等弧菌发生微弱交叉反应,提高稀释度到160时,不发生交叉反应。假交替单胞菌抗血清基本不与常见海水致病弧菌发生交叉反应。人工感染试验检测结果表明该方法能从患病海参溃烂组织、未发病海参组织和感染水体检测到相应致病菌,检测灵敏度为9.4×103个/mL。人工感染试验检测结果经直接凝集反应验证。该方法操作简便、灵敏度高,不需复杂仪器设备,适合在基层推广。

庆大霉素快速Dot-ELISA检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种适用于快速、现场检测要求的庆大霉素残留Dot-ELISA检测方法。将硝酸纤维素膜用激光切割成小圆片,粘贴到激光打孔的塑料胶条上,制成8个圆片组成的NC膜检测条。通过条件优化,建立了基于NC膜条的庆大霉素残留直接竞争Dot-ELISA检测方法。结果表明,该方法可以快速检测牛奶等食品中的庆大霉素残留,检测灵敏度达到60 ng/mL,可用于庆大霉素残留的筛查。与微孔板ELISA相比,Dot-ELISA可以大大节省检测时间。直接竞争Dot-ELISA具有简便、快速、灵敏、直观的特点,具有推广和应用价值。

应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌

研究了应用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-Enzym e L inked Immunosorbent Assay,Dot-ELISA)技术检测副溶血弧菌Vibrio parahaem olyticus的方法。根据棋盘试验,确定副溶血弧菌免疫血清最佳工作浓度为1∶200,酶标抗体最佳工作浓度为1∶100,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,副溶血弧菌呈阳性,哈维氏弧菌V.harveyi、嗜水气单胞菌Aerom onas hydrophila、河流弧菌Vf.luvialis biotype、溶藻弧菌V.alginolyticus、大肠杆菌Escherichia coli均呈阴性。斑点ELISA方法不仅具有快速、经济的特点,而且可用肉眼直接判定结果,适合在基层单位应用推广。

应用斑点酶联免疫法快速检测创伤弧菌

建立了斑点酶联免疫(Dot-ELISA)技术检测创伤弧菌的方法。结果表明,创伤弧菌免疫血清最佳工作浓度为1∶100,酶标抗体最佳工作浓度为1∶1 600。Dot-ELISA法对创伤弧菌具有高的特异性,它与多株致病菌均无交叉反应,其对创伤弧菌的最低检测阈值为103CFU/m L。应用Dot-ELISA与常规鉴定法分别对人为污染创伤弧菌样品及贝类样品进行检测,两种方法检测结果一致。Dot-ELISA方法具有快速、经济和可用肉眼直接判定结果等优点,适合在基层单位推广应用。[中国渔业质量与标准,2014,4(6):27-31]

应用Dot-ELISA快速检测牙鲆腹水病病原的研究

选用硝酸纤维素膜作固相载体,建立检测迟钝爱德华氏菌的斑点酶联免疫吸附试验诊断方法。根据棋盘试验,确定迟钝爱德华氏菌免疫血清最佳工作浓度为1∶800,酶标抗体最佳工作浓度为1∶200,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,迟钝爱德华氏菌呈阳性,温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、腐败希瓦氏菌、产碱普罗威斯登菌、阪崎肠杆菌和大肠杆菌均呈阴性。试验结果表明,Dot-ELISA方法简便、特异、快速、结果直观,便于在基层推广使用。

快速斑点酶标法检测抗核抗体

目的建立一种快速、简便的抗核抗体（ANA）检测方法。方法采用快速斑点酶标法（Rapid-DotELISA,R-Dot-ELISA）检测20份ANA阳性系统性红斑狼疮（SLE）患者血清和20份阴性正常健康者血清的ANA。检测中采用不同浓度的核抗原、不同的封闭液、不同浓度的酶标抗体、不同显色时间,摸索最佳检测条件。确定检测条件后,采用R-Dot-ELISA法、ELISA法和免疫荧光法检测190例系统性自身免疫性疾病患者和50例健康者血清的ANA,比较R-Dot-ELISA法与ELISA法和免疫荧光法检测的一致性。结果核抗原浓度为40～160mg/L、封闭液为含1%牛血清白蛋白和10%～20%小牛血清的PBS,酶标抗体稀释度为1∶80～1∶320,显色时间3～5min。R-Dot-ELISA与ELISA法相比,检测结果一致率为95.4%（r=0.907,P〈0.05）,与免疫荧光法相比,检测结果一致率为96.7%（r=0.932,P〈0.05）。结论 R-Dot-ELISA检测ANA具有较高的敏感性及特异性,且快速、简便,适用于基层流行病学调查和临床快速诊断。

快速斑点酶标法检测抗丝聚蛋白抗体

目的建立一种快速、简便的抗丝聚蛋白抗体（anti-filaggrin antibody,AFA）的检测方法。方法采用快速斑点酶标法（Rapid-Dot-ELISA,R-Dot-ELISA）检测15份AFA阳性的类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者和15份AFA阴性的正常健康者血清的AFA。检测中采用不同浓度的丝聚蛋白、不同的封闭液、不同浓度的酶标抗体,摸索检测条件。确定检测条件后,采用R-Dot-ELISA和ELISA法检测100例RA患者和150例包括系统性红斑狼疮（SLE）、强直性脊柱炎等非RA的自身免疫病患者和50例健康者血清的AFA,比较两种方法检测AFA的一致性,并判断R-Dot-ELISA检测AFA对RA的诊断价值。结果丝聚蛋白浓度为40-160μg/m L,封闭液为含1%BSA和10%小牛血清的PBS,酶标抗体稀释度为1∶80-1∶320是较合适的检测条件。R-Dot-ELISA与ELISA法检测AFA,结果一致率为98%（r=0.947,P〈0.05）,对RA诊断的敏感度、特异度等统计学指标无差异。结论 R-Dot-ELISA检测AFA快速、简便,且对RA的诊断具有较高的敏感性及特异性,适用于基层流行病学调查和临床快速诊断。

丰产鲫败血症病原CSS-4-2的Dot-ELISA快速检测

应用Dot-ELISA法对丰产鲫败血病病原菌豚鼠气单胞菌CSS-4-2菌株的全菌抗原进行检测,其最低检出水平为105 cells/mL.Dot-ELISA法对人工感染CSS-4-2菌株濒临死亡或有明显症状丰产鲫的肝、脾、肾组织匀浆上清液的阳性检出率为97%;而对未显症状丰产鲫的肝、脾、肾组织匀浆上清液的阳性检出率为25%.同时发现当感染浓度较高(≥109 cells·mL-1)时,攻毒3h后在脾脏中就能检出病原菌.

禽流感病毒特异性NP单克隆抗体的鉴定及禽流感特异性检测方法的建立

目的筛选鉴定禽流感病毒特异性单克隆抗体（单抗）并建立一种适合禽源流感病毒特异性检测的抗原检测方法。方法利用分子进化树分析方法对甲型流感病毒核蛋白（NP）基因进行分类，从禽流感病毒分支和人流感病毒分支上各挑选一个代表性流感病毒株的NP基因进行重组抗原的表达及其单抗的筛选制备，最后应用免疫渗滤技术（A-Dot-ELISA）建立抗原快速检测方法。结果根据分子进化树分析结果确定禽流感H5N1病毒株HK／212／2003和人流感HINl病毒株CA／04／2009的NP基因进行原核表达，获得高纯度的禽流感病毒NP重组抗原rNP—HK／212和人流感病毒NP重组抗原rNP—CA／04；利用上述两种NP抗原制备出抗rNP～HK／212单抗53株，通过差异筛选获得只对禽流感病毒NP蛋白rNP—HK／212有特异性反应而不与人流感病毒NP反应的3株单抗（1F2，5D2及25A2）；免疫荧光方法证实1F2等3株单抗只特异识别禽流感病毒；利用单抗1F2成功建立一种适于禽流感病毒特异性检测的抗原快速检测方法AIV-Dot-ELISA，该方法对病毒滴度为0．025～O．1HAtiter的19个不同亚型的禽流感病毒均能检出，对病毒滴度为5HAtiter的8个人流感病毒和2个乙型流感病毒的检测均为阴性。结论本研究成功制备出禽流感病毒NP蛋白特异性单抗，并建立了一种仅特异识别禽流感病毒的抗原快速检测方法AIuDot-ELISA，为快速鉴别禽类流感病毒和人类流感病毒感染提供了一种有用的分析检测工具。

基于适配分子及Dot-ELISA快速检测氯霉素残留

目的:建立一种快速、灵敏、特异的基于适配子及Dot-ELISA的氯霉素残留检测方法。方法:选取一种能与氯霉素特异性结合的DNA适配分子,人工合成并用生物素标记。把含有不同浓度氯霉素的样品结合于硝酸纤维膜上,然后与生物素标记的适配子于55℃孵育1 h,洗脱,接着与亲和素标记的辣根过氧化物酶孵育,DAB显色。结果:成功建立了基于适配分子的Dot-ELISA检测氯霉素残留的方法,可以快速检测牛奶等食品中的氯霉素残留,检测灵敏度达10-7g/L。结论:所建立的基于适配分子的Dot-ELISA方法可快速检测氯霉素残留,且具有灵敏性高、特异性强等特点,可作为抗生素残留筛查的较好选择,有广阔的应用前景。

免疫渗滤法在甲型流感病毒筛查中的应用

目的评价免疫渗滤法在筛查临床甲型H1N1流感病毒感染中的诊断效率。方法收集2009年6月-10月医院发热门诊流感样病例咽拭子标本297例,分别用免疫渗滤法和实时荧光定量PCR检测,以评价免疫渗滤法的诊断效率。结果在297份咽拭子标本中,实时荧光定量PCR法检测为甲型H1N1流感166份,免疫渗滤法检出115份,两种方法检测均为阳性91份,均为阴性107份,灵敏度为54.82%,特异度为81.86%,阳性预测值为79.1%,阴性预测值为58.8%,总符合率66.67%,两种方法在甲型流感病毒检测中差异无统计学意义。结论免疫渗滤法可用于甲型流感病毒筛查,显示出良好的临床应用前景。

改良DAS-Dot-ELISA检测西瓜细菌性果斑病菌

以硝酸纤维素膜为载体,对Dot-ELISA法的封闭条件、包被抗体浓度、点样量等反应条件进行优化,建立改良DAS-Dot-ELISA法快速检测西瓜细菌性果斑病菌。研究发现,以含乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的脱脂奶粉液高温处理后用于封闭,可有效降低背景;轻微振荡可提高杂交效率,减少非特异性结合。改良DAS-Dot-ELISA可快速、经济的检测西瓜果斑病菌,灵敏度达1.9×105CFU/mL。在对两批次种子样品的检测中,改良DAS-Dot-ELISA法检测带菌率分别为8.0%和6.0%,与微孔板ELISA结果完全一致;对每粒种子的检测结果,改良DAS-Dot-ELISA法与微孔板ELISA吻合率平均达99.0%,显示较好的实用前景,同时为快速检测西瓜果斑病菌提供一种新途径。

基于适配分子的Dot-ELISA快速检测抗生素残留

目的本研究旨在建立一种快速、灵敏、特异的抗生素残留检测方法。方法通过选取两种分别能与氯霉素、卡那霉素特异性结合的适配分子,把含有不同浓度氯霉素、卡那霉素的模拟样品结合于硝酸纤维膜上,通过条件的优化,建立基于适配分子的Dot-ELISA快速检测氯霉素、卡那霉素残留的方法。结果该方法可以快速检测牛奶等食品中的氯霉素、卡那霉素残留,检测灵敏度达10-7g/L。结论与现有的氯霉素、卡那霉素残留检测方法相比,基于适配分子的Dot-ELISA方法可快速检测氯霉素、卡那霉素残留,且具有灵敏性高、特异性强等特点,可根据这两种抗生素的检测方法与条件为基础,延伸到其他抗生素残留的检测,可作为抗生素残留筛查的较好选择,有广阔的应用前景。