RACE法分离团头鲂生长抑素全长cDNA及其序列测定

生长抑素具有抑制脑垂体GH释放的作用,是调控鱼类生长的主要激素之一。本研究采用RT和RACE(rapid amplification of cDNA ends)法,分离和测定了团头鲂脑中生长抑素PSSI cDNA的全长核苷酸序列,并对该基因进行了结构和系统进化分析。3’RACE扩增得到700bp左右的片段,5’RACE分离得到500bp左右的片段,把3’片段与5’片段拼接得到全长cDNA。cDNA全长735bp[不含poly(A)],5’端非翻译区有100nt,3’端290bP[不包含poly(A)],阅读框(open reading frame,ORF)345bp。该序列与金鱼PSSI cDNA序列同源性为90％,主要差异在5’端非翻译区。团头鲂生长抑素mRNA阅读框编码114个氨基酸,包括一些酶切位点,产生26个氨基酸的大分子态生长抑素,进一步加工成与人等结构相似的14个氨基酸的生长抑素;团头鲂生长抑素前体氨基酸序列与金鱼、虹鳟、鲶鱼、鮟鱇、蛙、牛、鼠、鸡、猴、人等的比较发现,它与金鱼的同源性最高达95％,与鮟鱇最低50％,与人68％。这说明生长抑素基因在长期的进化中相当保守,同时,也因为鱼类生活环境多样导致基因变异较大。

用RACE结合cDNA文库筛选的方法获取新的锌指蛋白基因

大多数有重要功能的蛋白质都含相应的由保守氨基酸顺序组成的功能结构域。本文首先根据蛋白质功能结构域保守氨基酸序列设计简并引物 ,用PCR方法扩增出基因EST序列 ,再利用改进的快速扩增cDNA末端(RACE)方法从cDNA文库中扩增出基因非同源部位 ,然后以非同源序列为探针 ,筛选cDNA文库。利用此方法成功地从人骨髓cDNA文库中克隆到几个编码锌指蛋白并代表原有EST的新的全长cDNA。这一策略也应适用于筛选编码具有其他序列保守性功能结构域蛋白的基因。

RLM-RACE法扩增獐茅液泡膜Na^+/H^+逆向转运蛋白基因5′-cDNA末端序列

根据已获得的盐生植物獐茅(Aeluropus littoralisvar.sinensisDebeaux)液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+antiporter)基因部分cDNA片段,设计2条特异引物(GSP1、GSP2),采用RLM-RACE(RNA ligase-medi-ated rapid amplification of 5′and 3′cDNA ends)法获得了其5-′cDNA末端序列,并找出了转录起始位点。该片段长816 bp,与芦苇液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因序列同源性最高达91%,与拟南芥、盐角草、水稻、大麦、小麦的同源性分别为81%、82%、86%、87%和81%,为该基因全长的克隆及启动子的研究奠定了基础。与其它测定基因转录起始位点的方法相比,RLM-RACE方法更快捷、简便、准确。

RACE: cDNA末端快速扩增技术进展

ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端快速扩增技术进展明洪黄秉仁中国协和医科大学基础医学院中国医学科学院基础医学研究所国家分子生物学重点实验室北京１００００５基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。以...

水稻TAF12b基因cDNA克隆及其分子特性鉴定

【目的】明确水稻通用转录因子TFⅡD复合物组分中的OsTAF12b的选择性剪接形式并鉴定其亚细胞定位及其表达模式,为深入研究OsTAF12b功能提供基础性信息。【方法】利用5'-/3'-RACE技术扩增并克隆了OsTAF12b基因的全长cDNA;通过生物信息学进行了多重序列比对和进化树构建;利用激光共聚焦显微镜观察OsTAF12b的亚细胞定位;通过qRT-PCR技术分析了该基因在非生物逆境下的表达模式。【结果】发现OsTAF12b基因有4个选择性剪接转录本,其在编码区内仅存在一个赖氨酸的差异。OsTAF12b与其他禾本科植物成员高度同源且在进化树中聚在一个分支上。在本氏烟叶片细胞和水稻原生质体中融合GFP标签的OsTAF12b蛋白均与细胞核标记蛋白H2B共定位。OsTAF12b转录本在水稻叶片中的积累水平较高,而且在多种非生物逆境胁迫下显著上调表达。【结论】水稻OsTAF12b基因存在4种选择性剪接产物,可编码2个仅相差1个赖氨酸残基的细胞核蛋白。表达模式分析表明OsTAF12b可能参与水稻多种非生物逆境胁迫响应过程。

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。经典cDNA文库存在克隆的片段短等缺点,而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息,从而克隆cDNA全长;对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库,可以增加克隆低丰度mRNA的机会;差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义;改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主,介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1483bp,由长92bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257bp的3′非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%～99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。

油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析

在已知油茶乙酰COA酰基转移酶基因EST序列基础上,设计6条特异引物,以油茶优良无性系‘湘林1号’种仁总RNA为模板,通过反应体系和反应条件优化,最终扩增出一条700 bp左右的目的片段,将该片段回收、克隆、测序,获得718 bp的cDNA序列,将该序列与油茶乙酰COA酰基转移酶基因进行序列拼接,确定了油茶乙酰COA酰基转移酶基因的全长cDNA序列,将该序列提交至GeneBank,登录号为GU594059。油茶乙酰COA酰基转移酶基因全长cDNA序列为1 495 bp,含有一个1 227 bp的ORF,编码408个氨基酸残基。在氨基酸序列水平上,该基因与胡黄连(P.kurrooa)的乙酰COA酰基转移酶基因的相似性最高,为86%,与稻瘟病菌(M.grisea)的最低,为65%。通过在线预测,油茶乙酰COA酰基转移酶基因编码蛋白的等电点pI为6.19,分子量Mw为41 628.6 Da。本研究为揭示油茶油脂合成规律和油茶的分子育种提供了理论依据和科学基础。

马尾松毛虫CPV基因组第7片段的cDNA克隆及序列分析

利用琼脂糖凝胶电泳分离马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)基因组dsRNA,并回收纯化第7片段(S7).经逆转录和PCR扩增,获得2个亚克隆片段并测序.再根据已测序列设计引物,利用RNA连接酶介导的RACE法得到S7两端克隆并测序.通过拼接可得到DpCPVS7全序列.经过序列分析发现,S7全长1502bp,5′端具有CPV 1型末端保守序列AGTAA,3′端具有保守序列GTTAGCC.起始密码子ATG位于25～27残基,终止密码子TAG位于1373～1375残基,推测S7片段编码448个氨基酸多肽,分子量约为5.0×107.与舞毒蛾质型多角体病毒(LdCPV 1)和家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第7片段相比较,核苷酸同源性分别为99%和86%.

爪哇根结线虫-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长克隆和序列分析

以爪哇根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3′末端和5′末端的RACE,获得-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长。此cDNA全长序列为1 675 bp,包括1 521 bp的完整ORF,编码一含506 aa的多肽。该基因命名为M j-eng3-,其推导蛋白的编码氨基酸与南方根结线虫的-β1,4-内切葡聚糖酶基因M I-ENG-1、M I-ENG-3和M I-ENG-4的同源性为95.3%、95.8%和85.3%,与另外5个植物寄生线虫β-1,4-内切葡聚糖酶基因推导蛋白PP-ENG-1、GR-ENG-1、GT-ENG-1、HG-ENG-1、HS-ENG-1编码氨基酸的同源性分别为51.2%、43.7%、43.7%、46.8%和45.3%。

西伯利亚鲟Sox9基因cDNA全长克隆、序列分析及其表达检测

为了研究Sox9基因在西伯利亚鲟侧线神经发育过程当中所起的调控作用,本研究利用RT-PCR和RACE方法获得了西伯利亚鲟Sox9基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆Sox9cDNA全长为1409bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)1083bp,5′端非翻译区(untranslate dregion,UTR)19bp和3′端非翻译区(untranslate dregion,UTR)307bp。1083bp的ORF共编码360个氨基酸,相对分子质量为41221.7U。序列分析表明,其与施氏鲟的亲缘关系较近,其次是斑马鱼。经实时荧光定量PCR技术对西伯利亚鲟Sox9基因在各组织以及在胚胎发育各时期中的相对表达量检测发现,Sox9在西伯利亚鲟中的表达具明显的组织差异性和时间差异性。其中,在肝,肾,肌肉,胰中的相对表达量较低。然而,大脑组织中的表达量与以上4个组织相比,处于极高水平,达到胰脏中相对表达量8.9倍,达到表达量最低点肾脏中的近21倍。在胚胎发育的不同阶段,Sox9均有表达。在原肠期、神经胚期及视泡形成期,Sox9基因的表达量均较高,特别是在原肠期其表达量达到西伯利亚鲟整个胚胎发育期的最高点,相当于表达量最低点心脏形成期的1.9倍。在神经胚期和视泡形成期,Sox9的相对表达量也相对处于较高水平,仅比原肠期略低,其相对表达量是心脏形成期1.2倍和1.4倍。本研究将为今后深入研究Sox9基因在西伯利亚鲟侧线神经节分化发育、细胞迁移过程中所起的调控作用积累资料。

谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1372bp,开放阅读框长1131bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66bp和175bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。

高山红景天中糖基转移酶家族cDNA全长基因的克隆

为了获得高山红景天中红景天苷生物合成关键酶——UDP-糖基转移酶家族基因的全长cDNA序列,采用在线简并引物设计软件结合3′-RACE技术获得两个糖基转移酶基因的3′端部分序列,进一步采用不同的5′-RACE试剂盒扩增两个基因的5′端序列,结果显示利用Takara公司的试剂盒扩增可以得到cDNA全长序列(GenBank登录号为EF508689和EU567325),而采用Invitrogen公司的试剂盒得到的序列不包括全部开放读码框。实验证明,利用Takara公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit克隆获得基因全长序列的比率更高。

胃癌相关cDNA片段的快速克隆和表达分析

利用差异显示PCR技术获得的一条在胃癌和正常组织有差异表达的表达序列标签 (EST) W 12 3(GenBank登录号为AF15 0 6 31) ,通过与GenBank的dbest库进行电子杂交 ,选取了与其同源度高的若干EST ,在它们共有的保守序列设计了用于扩增的寡聚核苷酸引物 ,利用cDNA末端快速扩增PCR (RACE)技术得到了7条带有 polyA尾的 3′EST ,进行序列分析后 ,发现它们均是代表新基因或不同剪接体的EST ,且具有共同的保守序列 ,已登录GenBank .采用RNA印迹对目的序列进行初步鉴定 ,并进行了这些基因的组织分布分析 .RACE技术和生物信息学相结合 ,具有快速、高效的特点 ,有助于疾病相关基因的克隆 .

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)微管相关蛋白全长cDNA克隆及表达分析

从巴西橡胶树Heveabrasiliensis差减cDNA文库中分离到微管相关蛋白(Microtubule-associatedprotein,MAPs)基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为788bp的全长cDNA,该基因在GenBank中的登录号为AY461412。序列分析表明该基因包含完整的开放阅读框,编码144个氨基酸,与微管相关蛋白基因家族具有很高的同源性,推测该基因是微管相关蛋白基因。半定量RT-PCR检测证实它在胶乳中的表达强于叶中,胁迫处理(伤害及乙烯处理)使其表达上调。

人UCA1基因新剪接变异体全长cDNA序列的克隆

目的克隆新的UCA1剪接变异体全长cDNA序列,为研究其可变剪接机制奠定基础。方法用电子克隆技术和cDNA序列末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增细胞系BLZ-211cDNA并进行产物测序和序列拼接。结果新克隆的UCA1剪接变异体全长cDNA序列为2 202bp。结论综合采用电子克隆技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法,为该基因的后续可变剪接机制的研究奠定了基础。

人脑红蛋白(NGB)全长cDNA序列的克隆

人脑红蛋白 (neuroglobin ,NGB)是新发现的神经系统特异的携氧蛋白 ,然而其全长cDNA序列一直未见报道 .采用电子序列延伸技术和cDNA序列末端快速扩增技术 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE)研究发现 ,人NGB全长cDNA序列为 190 9bp,5′非编码区为 375bp ,编码区 (45 6bp)可编码 15 1个氨基酸 ,3′非编码区为 10 78bp,其中含 2 7bp的 poly (A) (GenBank接受号 :AF4 2 2 797) .综合采用电子序列延伸技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法 ,为后续的功能研究提供了重要基础 .

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的分离与鉴定

利用抗病基因的保守结构设计引物,从抗叶锈病近等基因系材料TcLr24中扩增出一条703bp的条带RGA1,通过与GenBank比对,选取与RGA1高度同源的若干条带,在它们共有的保守序列位置设计引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增抗病同源基因cDNA全长。扩增到3条全长cDNA,经BLASTp比较,这些序列都含有NBS保守结构域和多个LRR结构域,与很多已知植物抗病基因的功能相应区域一致。对FRGA-1、FRGA-2和FRGA-3实时定量PCR分析,表明这3个基因在小麦叶片中都是组成型表达。本研究在小麦材料TcLr24中得到3条抗病基因同源cDNA全长,为研究小麦抗病基因奠定了基础。

小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析

根据已克隆植物抗病(R)基因NBS保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),在小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中进行抗病同源基因cDNA全长的扩增。获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S11A11cDNA序列,该序列全长2923bp,编码878个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域。聚类分析表明,S11A11编码的蛋白与小麦抗叶锈病基因Lr1编码的蛋白亲缘关系较近,而与Lr10亲缘关系较远。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病基因同源序列,为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础。

马尾松苯丙氨酸解氨酶基因cDNA全长克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是连接植物初级代谢和次级代谢途径关键酶、限速酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、木质素等次生代谢产物的合成,在植物抗病过程中有重要意义.采用RT-PCR和RACE技术,从马尾松中克隆到PAL基因的cDNA全长.此cDNA全长2 700 bp,包括2 154 bp的完整ORF,编码717个氨基酸的蛋白,相对分子质量与等电点分别为78 200和5.81.其推导的蛋白序列与火炬松(Pinustaeda)、欧洲赤松(Pinus sylvestris)和海岸松(Pinus pinaster)的苯丙氨酸解氨酶同源性分别为98.2%、99.4%和97.8%.