PI3K/Akt信号通路参与LPS诱导大鼠肺微血管内皮细胞表达RACK1及rac1

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺微血管内皮细胞(PMVEC)表达活化的蛋白激酶C受体1(RACK1)和ras相关C3肉毒菌毒物底物1(rac1)的影响。方法体外培养大鼠PMVEC:①LPS量效组:0、1、5、10 mg/L LPS与大鼠PMVEC孵育12 h;②LPS时效组:10 mg/L LPS与PMVEC孵育0、3、6、8、12、24 h;③IGF-1时效组:100 ng/ml IGF-1与PMVEC孵育0、3、6、8、12、24 h;④LPS+LY294002组:100 ng/ml LY294002预孵育PMVEC 1 h后加入10 mg/L LPS继续孵育12 h,设空白组、LPS组和LY294002组为对照。所有干预结束后Western blot法检测RACK1、rac1及p-Akt蛋白表达。结果①LPS量效组:RACK1、rac1及p-Akt蛋白表达量均呈浓度依赖性增加,各蛋白组组内比较差异均有统计学意义:(F=120.455,P<0.001)、(F=165.813,P<0.001)及(F=309.346,P<0.001)。②LPS时效组:RACK1和rac1蛋白表达呈时间依赖性增加,LPS刺激24 h后达最高,各蛋白组组内比较差异均有统计学意义:(F=454.034,P<0.001)和(F=423.630,P<0.001);p-Akt表达自3 h(0.460±0.089)上调,12 h达最高(2.022±0.244),24 h(1.264±0.074)仍高于0 h(0.237±0.063),组间比较差异有统计学意义(F=137.726,P<0.001)。③IGF-1时效组:IGF-1诱导PMVEC表达RACK1、rac1及p-Akt呈时间依赖性增加,各组组间比较差异有统计学意义(F=188.293,P<0.001)、(F=115.071,P<0.001)及(F=60.175,P<0.001)。④LY294002干预组:LPS+LY294002作用PMVEC后:RACK1蛋白表达量较LPS组下调[(0.732±0.137)vs(1.498±0.167),P<0.001];rac1蛋白表达量较LPS组下调[(0.758±0.084)vs(1.384±0.170),P<0.001];p-Akt蛋白表达量较LPS组下调[(0.492±0.148)vs(1.106±0.219),P<0.001]。结论 PI3K/Akt信号通路通过干预RACK1和rac1表达,参与LPS致PMVEC损伤。

Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物3在1型糖尿病和树突状细胞中的作用初探

目的初步探索ras相关C3肉毒杆菌毒素底物3(RAC3)在1型糖尿病(T1DM)和树突状细胞(DC)中的作用。方法选取来自广东省T1DM转化医学研究中2011至2016年入组后规律随访的T1DM患者作为病例组,选择2011至2016年来自中山大学附属第三医院就诊的正常糖耐量者作为健康对照组。病例组和对照组均在筛选阶段进行全外显子组测序,在验证阶段进行基因分型。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建C57BL/6小鼠背景的RAC3全身敲除(KO)小鼠模型。使用聚合酶链反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blotting法分别验证RAC3在DNA、RNA和蛋白水平是否被敲除。通过流式细胞染色检测RAC3 KO小鼠和同窝野生对照(WT)小鼠(每组3只)的DC分化比例以及主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHCⅡ)、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平。采用logistic回归分析法比较病例组和对照组之间等位基因频率分布的差异。组间比较采用独立样本t检验。结果筛选阶段共纳入72例T1DM患者和487名健康对照,验证阶段共纳入122例T1DM患者和577名健康对照。筛选阶段结果显示,T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照[分别为7.64%(11/144)和1.13%(11/974),OR=9.38,P<0.001]。验证阶段基因分型结果同样显示,T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照[分别为4.50%(11/244)和1.13%(13/1154),OR=4.14,P<0.01]。WT小鼠和RAC3 KO小鼠的DC分化比例差异无统计学意义(分别为85.6%±1.1%和83.3%±0.25%,P=0.08)。WT小鼠和RAC3 KO小鼠DC中MHCⅡ、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论遗传学研究提示RAC3可能是人类T1DM的易感基因,但可能不通过DC参与T1DM的发生。