青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导大鼠胰岛细胞损伤的保护作用

目的:观察青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导大鼠胰岛细胞瘤细胞(INS-1)损伤的保护作用。方法:用高糖诱导INS-1细胞损伤模型。MTT法检测青钱柳水提物、30%、60%和90%醇提物对INS-1细胞增殖的影响,荧光酶标仪检测青钱柳不同溶剂提取物对胞内活性氧(ROS)含量的影响,用ELISA法测定其胰岛素分泌能力,比色法测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;比色法测定INS-1中Caspase-3、Caspase-9活性,荧光定量PCR测定Bcl-2和Bax mRNA表达,并计算Bcl-2/Bax比率。结果:33 mmol/L葡萄糖处理INS-148 h后可见INS-1细胞数目明显减少、细胞边缘模糊、触角收缩聚集、形态变圆,LDH释放量增加,与正常对照组比较,培养液中的NO和细胞内的ROS、MDA含量、Caspase-3、Caspase-9活性和Bax mRNA表达明显升高,胰岛素分泌量和细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性和Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比率明显降低(P<0.01)。与模型对照组比较,用青钱柳不同溶剂提取物干预后INS-1细胞凋亡被显著抑制,培养液或细胞中NO、ROS、MDA含量,Caspase-3、Caspase-9活性,LDH释放量及Bax mRNA表达明显降低,胰岛素分泌和细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性、Bcl-2 mRNA表达及Bcl-2/Bax比率明显增加(P<0.05或者P<0.01)。结论:青钱柳不同溶剂提取物对高糖诱导INS-1细胞损伤有保护作用,其作用机制与增强内源性抗氧化系统功能、抑制线粒体依赖性凋亡密切相关;其作用效果由强到弱依次为青钱柳水提物、30%、60%和90%醇提物。

香菇多糖抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡的作用及机制

目的探讨香菇多糖（lentinan，LNT）对链脲佐菌素（streptozoein，STZ）诱导的大鼠胰岛素瘤细胞系（INS-1）细胞凋亡的影响，并探索其可能的作用机制。方法四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法观察STZ单独处理、STZ和不同浓度LNT共同处理INS-1细胞24h后细胞活力的改变：AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡；Hoechst33258染色和末端转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL）法验证STZ和LNT的处理对INS-1细胞凋亡的影响；放免法检测经药物处理后INS-1细胞贮存、分泌胰岛素的功能；Western印迹分析经STZ、LNT处理后INS-1细胞相关信号通路蛋白PDX-1、Bcl-2（抗凋亡基因）、Bax和Cleavedeaspase-3（促凋亡基因）的表达差异。结果与空白组相比，LNT能浓度依赖性地抑制STZ引起的INS-1细胞活力下降，浓度为200μg／ml时开始有统计学差异（P〈0．05）；LNT能抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡；LNT可抑制STZ诱导的INS-1细胞贮存、分泌胰岛素功能受损和PDX-1蛋白表达量下降；LNT能影响细胞凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase．3表达水平。结论香菇多糖能抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡，可能是通过影响凋亡信号通路中相关蛋白分子的水平实现的。

血管紧张素Ⅱ2型受体重组腺病毒的扩增及其在INS-1细胞中的转染

目的利用人胚肾(HEK)293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS-1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和对照病毒Ad-CMV-EGFP,并测定病毒滴度。在INS-1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad-G-AT2R-EGFP和Ad-CMV-EGFP的滴度分别为9×109和8×109pfu/ml。在INS-1细胞中转染Ad-GAT2R-EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值(P<0.05),同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad-CMV-EGFP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS-1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。

miR-149靶向抑制胰岛β细胞中FGF21表达对胰岛素分泌的影响及机制研究

【目的】探讨胰岛β细胞中miR-149对成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)靶向调控作用及抑制胰岛素分泌的作用机制,以期更好地了解糖尿病发病机制并为糖尿病诊断治疗提供新靶点。【方法】生物信息学预测靶向调控FGF21的miRNA;双荧光素酶报告基因检测实验验证靶向调节关系;q PCR检测大鼠胰岛素瘤细胞株(rat insulin-secreting betacell line,INS-1)胰岛β细胞中miR-149与FGF21 mRNA表达;应用酸醇提取INS-1胰岛β细胞中胰岛素,放射免疫法检测细胞内胰岛素含量;分别用5.6、16.7 mmol/L葡萄糖建立基础糖刺激胰岛素分泌模型(basal insulin secretion model,BIS)、高糖刺激胰岛素分泌模型(high glucose stimulates insulin secretion model,GSIS),放射免疫法测定各处理组胰岛素分泌量;western blotting检测INS-1胰岛β细胞中FGF21、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的表达。【结果】MiR-149是潜在靶向调控FGF21的miRNA,其过表达可显著抑制FGF21荧光素酶活性,FGF21 3'URT中miR-149结合位点突变后荧光素酶活性恢复。过表达miR-149靶向抑制FGF21 mRNA与蛋白表达,进而降低INS-1细胞内胰岛素含量及分泌量,而外源过表达FGF21恢复了miR-149的抑制作用。MiR-149可靶向FGF21表达抑制其下游JNK、ERK信号通路活性。【结论】本研究揭示了在INS-1胰岛β细胞中,miR-149可通过直接靶向FGF21阻断其下游JNK、ERK信号通路抑制胰岛β细胞分泌胰岛素,进一步揭示了糖尿病发生发展恶化机制,为临床诊断治疗提供了新思路。