竹鼠源细小病毒分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】了解并掌握广西地区竹鼠细小病毒(Bamboo rat parvovirus,BRPV)的生物学特性及遗传变异情况,为BRPV的防控提供理论依据和技术支撑。【方法】用养殖场患病死亡的竹鼠病料制备组织上清液,采用Vero细胞同步接毒法进行病毒分离,通过细胞病变观察、PCR、透射电镜观察及血凝试验等方法鉴定,设计合成特异性扩增引物对BRPV全基因组序列进行测序分析。【结果】分离获得的病毒可在Vero细胞上稳定生长增殖,感染细胞变长、变梭或成拉丝状;病毒纯化后经电镜观察可见呈立体对称、无囊膜、直径20~25 nm的病毒粒子;经PCR鉴定、凝集试验及全基因组测序表明,分离株为BRPV。本研究共获得3株BRPV(GenBank登录号:MF497824、MF497825、MF497826),毒株基因组全长约4758 bp,全基因组序列比对发现,其与蝙蝠源细小病毒关系较近。BRPV基因编码氨基酸遗传特征与其宿主特异性有很强的相关性,NS 1基因编码氨基酸变异与蝙蝠及大鼠源细小病毒更接近,与其处于同一分支,核苷酸相似性为96.9%~97.6%,氨基酸相似性为97.5%~98.4%。其中第257和360位氨基酸属于高突变位点;基于VP 2基因编码氨基酸的遗传进化树显示,其进化树处在一个独立的分支上,与大鼠源及犬、猫等动物源细小病毒核苷酸相似性为58.3%~66.8%,氨基酸相似性为51.6%~63.0%。VP2蛋白第8、99、114、118、247和253位氨基酸存在宿主偏好性,第53和386位氨基酸属于高突变位点。【结论】本研究分离获得的BRPV为一种细小病毒,本研究结果明确了中国BRPV遗传特性及病毒粒子形态特征,为BRPV的流行病学调查及防控奠定了基础。

大鼠细小病毒H-1株和KRV株双重PCR检测方法的建立及应用

目的建立大鼠细小病毒H-1和KRV株双重PCR方法并对方法进行初步应用。方法根据NCBI发表的H-1(NC_001358)和KRV(U790330)基因组序列分别设计特异引物,以H-1和KRV病毒DNA为模板建立双重PCR方法,对方法进行优化后验证方法的敏感性和特异性;经口感染大鼠,分为H-1和KRV单独感染组和混合感染组,感染后第2,4,6,8,10天采集大鼠粪便,第10天处死所有大鼠,采集心、肝、脾、肺、肾和盲肠内容物等组织,用建立的方法对粪便和组织样本进行检测。结果建立的双重PCR方法以H-1和KRV为模板能够分别扩增出183 bp和302 bp 2个条带,敏感性验证显示能够检测到的最低H-1量为3.8 pg/m L,最低KRV量为0.73 pg/m L;在以小鼠微小病毒、犬细小病毒和猫细小病毒为模板时无任何条带扩增出,特异性良好。感染第2天在所有大鼠粪便中均检测到病毒核酸,感染大鼠均无明显临床症状,感染第10天采集组织,H-1在各组织的检出率分别是心50%(4/8),肝50%(4/8),脾62.5%(5/8),肺50%(4/8),肾37.5%(3/8),盲肠内容物62.5%(5/8),且单独感染组检出率高于混合感染组;KRV在各组织的检出率分别是心0(0/8),肝25%(2/8),脾87.5%(7/8),肺12.5%(1/8),肾25%(2/8),盲肠内容物62.5%(5/8),混合感染组检出率高于单独感染组。结论建立的H-1和KRV双重PCR方法能够高效的检测大鼠粪便及组织中的病毒感染,可作为实验动物国家标准的有力补充。

检测大鼠细小病毒抗体的ELISA、IEA和HI法比较

对检测大鼠细小病毒(RV株)抗体的ELISA、IEA和HI三种方法作了比较。ELISA、IEA和HI法的重复性分别为92.5％、88.2％和68.6％。经对同一批血清检品的检测,ELISA法IEA和检测结果的符合率为90.5％,抗体阳性检出率均为81％,而HI与前两法的符合率均仅为69％,抗体阳性检出率为69％。以上结果表明:ELISA和IEA法在重复性和抗体阳性检出率方面均优于HI(P<0.05)。经ELISA法检测,普通级大鼠中RV抗体阳性率达59％,而在清洁级大鼠中仅为7％。

大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法。方法根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病毒(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法。根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1、KRV和RMV的引物。结果两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL。双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本。结论本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法。

H-1细小病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞C6机制的初步探讨

目的探讨H-1细小病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞C6后细胞因子水平的变化。方法取感染C6细胞后不同时间点的H-1细小病毒,同时取相同时间点的正常C6细胞,采用ELISA方法检测同时检测TNFα、IL-6、TGF-β1和IL-17A的表达水平。结果正常C6细胞中TNF-α、TGF-β1和IL-17A的浓度随培养时间增长而提高,IL-6浓度无明显变化;H-1细小病毒感染的C6细胞中TNF-α、TGF-β1和IL-17A浓度无明显变化,而IL-6浓度随感染时间推移而显著增加。结论 H-1细小病毒感染导致C6细胞中细胞因子表达水平的变化。

大鼠细小病毒VP2原核表达及间接ELISA方法建立

本研究以大鼠细小病毒(Rat parvovirus,RPV)VP2基因的原核表达产物为抗原建立检测RPV抗体的间接ELISA方法。通过比对分析大鼠细小病毒不同毒株的VP2蛋白序列,我们筛选出了RPV株VP2蛋白上长度为378 bp的特异性成熟肽序列,随后构建了pET30a原核表达体系,借助His标签对重组表达产物进行纯化,以纯化鉴定后的表达产物为抗原,免疫Balb/c小鼠制备多抗血清并建立检测大鼠细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA方法。结果显示,抗原包被质量浓度为0.28μg/mL,阳性判定标准初步定为OD450≥0.5,与H-1株和KRV株的阳性血清存在一定的交叉反应,批内试验变异系数小于10%。本研究建立的RPV VP2-iELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于大鼠细小病毒感染的血清抗体检测。

大鼠微小病毒和细小病毒双重荧光定量PCR检测方法建立

目的建立快速、准确地同时检测和鉴别大鼠细小病毒(RPV)和大鼠微小病毒(RMV)的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法。方法根据GenBank中已公布的RMV NTU1株全基因组序列(JX627317.1),在1 705～1 808 nt处设计引物和TaqMan探针,根据RPV NTUI毒株的全基因组序列(JX827169),在863-967nt处设计引物和TaqMan探针。以构建的质粒参考物为模板建立荧光定量PCR检测方法,并对该鉴别检测方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对50份临床样品进行检测,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)的商品试剂盒进行验证。结果建立的RMV和RPV的鉴别荧光定量PCR方法标准曲线的线性关系良好,R2值可达0.99,最低检测限均为10拷贝数/μL;应用鉴别荧光定量PCR方法和ELISA检测试剂盒,对100份大鼠肝脏和50份血清样品病料进行检测,结果均为阴性。结论建立的RMV和RPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、灵敏的特点,适用于RMV和RPV的临床监测。

大鼠细小病毒检测技术研究进展

大鼠细小病毒是一种DNA病毒,存在多种血清型,分为不同毒株。该病毒可自然感染实验大鼠和野鼠,不同毒株感染后临床症状不一。该病毒可对大鼠的组织或器官造成影响,导致大鼠生理生化参数改变,直接影响实验结果。因此,对感染大鼠的筛选鉴定至关重要。本文旨在系统阐述大鼠细小病毒检测技术的研究情况,对比不同的方法,提出了问题和展望,为实验动物质量控制提供帮助。