锌离子对大鼠腹膜间皮细胞转分化及TGFβ/Smad通路的影响

目的研究锌离子对脂多糖(LPS)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)转分化(EMT)的影响,为锌离子在腹膜透析中的应用提供理论基础。方法胰蛋白酶消化法培养原代大鼠腹膜间皮细胞、传代,经鉴定后分组:(1)对照组,(2)LPS组,(3)ZnSO4组,(4)ZnSO4/LPS组。应用Western blot方法、免疫荧光方法分别检测α平滑肌肌动蛋白(αSMA)、上皮钙黏素(E cadherin)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)、Smad2、Smad3、磷酸化的Smad2、3(P Smad2、3)蛋白表达;酶联免疫吸附方法检测上清液TNFα、TGFβ1的表达。结果与LPS组相比,ZnSO4/LPS组的αSMA的免疫荧光强度减弱;与对照组相比,LPS组RPMC的αSMA、collagenⅠ蛋白表达明显升高,而E cadherin蛋白表达降低。与LPS组相比,ZnSO4/LPS组RPMC的αSMA、collagenⅠ表达明显降低、E cadherin蛋白表达增多;LPS组上清液中TNFα、TGFβ1浓度显著高于对照组;ZnSO4/LPS组上清液中TNFα、TGFβ1浓度显著低于LPS组;与LPS组相比,ZnSO4/LPS组P Smad2、P Smad3的表达明显降低。结论 ZnSO4可能可以逆转LPS所致的RPMC的EMT,对腹膜透析过程中所导致的RPMCs损伤可能具有保护作用,其作用机制可能是通过抑制TGFβ/Smad信号传导通路。

锌离子对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响及机制

目的:研究锌离子(Zn)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)转分化(EMT)的影响及机制,从而为Zn在腹膜透析(PD)中的应用提供理论基础。方法:胰蛋白酶消化法原代培养腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组:(1)正常对照组;(2)LPS组:100μmol/L作用48h;(3)ZnSO4作用组:30μmol/L ZnSO4作用24h后加100μmol/L LPS作用48h。应用RT-PCR方法和免疫荧光方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)基因表达。应用Western Blotting检测核因子κB(NF-κB)、NF-κB抑制蛋白(I-κB)、磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)、磷酸化的I-κB(p-I-κB)蛋白表达;应用流式细胞术,采用活性氧自由基(ROS)检测试剂盒检测各组别的ROS情况。结果:LPS培养48h后细胞形态开始发生变化,由典型的上皮逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞,而硫酸锌(ZnSO4)作用组细胞表型改变明显减轻。与对照组相比,LPS组RPMC的α-SMA、CollagenⅠ基因表达明显升高,而E-cadherin基因表达降低;与LPS组相比,ZnSO4作用组RPMC的α-SMA、CollagenⅠ表达明显降低、E-cadherin基因表达增多;LPS组ROS显著高于对照组,ZnSO4作用组ROS显著低于LPS组;与LPS组相比,ZnSO4作用组p-NF-κB、p-I-κB蛋白表达降低。结论:ZnSO4可逆转LPS所致的RPMC的EMT,对腹膜透析过程中所导致的RPMC损伤具有保护作用,其作用机制可能是通过抑制氧化应激反应和NF-κB信号通路转导而发挥作用。

大鼠腹膜间皮细胞的分离培养方法

目的建立简便有效的大鼠腹膜间皮细胞(passage of rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)的体外培养方法。方法采用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化大鼠大网膜及脾胃韧带,细胞悬液进行离心培养,沉淀重悬后进行培养。通过形态学、免疫荧光、免疫组化法鉴定细胞。结果分离培养的细胞在光镜下呈铺路鹅卵石状,免疫荧光鉴定显示细胞角蛋白阳性,免疫组化鉴定显示波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子、白细胞CD45抗原阴性,证实培养的细胞为RPMC。结论胰蛋白酶消化法是一种简便而实用的分离RPMC的方法。

锌离子对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞凋亡的影响及机制

目的研究锌离子对脂多糖(LPS)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)凋亡的影响及机制的探索,从而为锌离子在腹膜透析中的应用提供实验基础。方法胰蛋白酶消化法培养原代大鼠腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组:①对照组;②LPS组;③ZnSO4组;④ZnSO4/LPS组。应用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测RPMC凋亡率,并采用Westen Blot方法检测细胞外信号调节激酶(PERK),BAX,凋亡诱导因子(AIF),天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶3(caspase3),天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶9(caspase9)蛋白表达。应用流式细胞术,采用活性氧自由基(ROS)检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况。结果与对照组相比,LPS组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白(BAX,AIF,caspase3,caspase9)表达升高(P<0.01)。与LPS组相比,ZnSO4作用组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白表达明显降低(P<0.01)。LPS组ROS显著高于对照组而ZnSO4作用组ROS显著低于LPS组(P<0.01,P<0.01)。与LPS组相比,ZnSO4作用组P-ERK的表达明显升高(P<0.01)。结论 ZnSO4可能可以逆转LPS所致的RPMC凋亡,对腹膜透析相关腹膜炎过程中所导致的RPMC损伤具有保护作用,其作用机制可能是通过ERK通路而发挥作用。

锌指蛋白A20对脂多糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞炎症效应的影响

目的探讨锌指蛋白A20(zinc finger protein A20)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)炎症效应的影响及可能机制。方法分离及培养RPMCs,常规传代及鉴定。取第2代细胞用于实验研究。将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组。脂质体转染A20质粒(pGEM-Teasy-A20)至RPMCs12h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液。用Western blotting检测细胞TLR4、p-IκBα、IκBα蛋白的表达;用ELISA法检测培养上清液IL-18蛋白水平。结果 LPS刺激8h后,转染A20组RPMCsTLR4蛋白表达水平无明显增高,与对照组相比,P=0.223;与LPS组及空载体组相比,差异有显著性(P=0.003,0.002)。LPS刺激1h后,转染A20组RPMCsp-IκBα蛋白无明显降解,p-IκBα/IκBα比值与对照组相比,P=0.553。与LPS组及空载体组相比,差异有显著性(P=0.001,0.001)。在LPS刺激12h后,转染A20组RPMCsIL-18蛋白分泌水平(479.12±85.79)pg/ml高于对照组(274.34±47.21)pg/ml(P=0.012),但明显低于LPS组(1049.45±185.01)pg/ml及空载体组(1028.77±192.90)pg/ml(P=0.011,0.015)。结论 A20通过对LPS信号通路中多个相关功能蛋白的负性调控作用,阻抑LPS诱导的RPMCs炎症效应。

肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞的增殖及其表达白细胞介素-1中的作用

目的初步观察肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞(Rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)细胞增殖及其表达白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)中的作用,从而为持续性非卧床腹膜透析(Continuous ambu-latory peritoneal dialysis,CAPD)中肝素的临床应用打下一定的理论基础。方法 建立RPMC的体外培养;并用四四氮唑蓝(MTT)细胞增殖实验和酶联免疫吸附方法(ELISA),来分析肝素对高糖(3.86％葡萄糖)影响RPMC增殖及其分泌IL-1的作用。结果 3.86％葡萄糖能显著抑制RPMC的增殖,而1.25U/ml肝素能部分逆转高糖对RPMC增殖的抑制作用(P<0.01);3.86％葡萄糖能显著增加RPMC表达IL-1β,而1.25U/ml肝素能部分减少高糖增加RPMC表达IL-1β的作用(P<0.01)。结论 本文结果提示,肝素可能通过逆转高糖对RPMC的增殖抑制作用及减少高糖增加RPMC表达促炎细胞因子IL-1的作用,而延缓CAPD相关性腹膜纤维化的发生,最终有益于CAPD进行。

锌指蛋白A20抑制脂多糖诱导大鼠腹膜间皮细胞NF-κB活化、CD_40表达及TNF-α的分泌

目的:探讨锌指蛋白A20(zinc finger protein A20)对脂多糖(LPS)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)炎症反应的影响。方法:分离及培养RPMCs,将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组。脂质体转染A20质粒(pGEM-T easy-A20)至RPMCs 24 h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液。用Western blotting检测细胞A20和IκBα(inhibitor of nuclear factor-κB-α)蛋白的表达;RT-PCR检测CD40和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达;用ELISA法检测培养上清液TNF-α蛋白水平。结果:与LPS组及空载体组相比,转染A20组RPMCs IκBα蛋白无明显降解(P<0.05);CD40、TNF-αmRNA表达及细胞培养上清液TNF-α蛋白水平均明显降低(P<0.05);与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:A20可抑制LPS诱导的RPMCs核转录因子-κB(NF-κB)活化及炎症反应。

异博定注射液对慢性腹膜透析大鼠腹膜透析功能及腹膜形态的影响

目的探讨不同剂量的异搏定对高糖透析液作用下,腹膜透析大鼠模型腹膜间皮细胞的形态和功能的影响及它们之间的关系。方法48只SD大鼠随机分为对照组和异博定低、中、高剂量组4组,腹膜透析30 d后进行腹膜功能试验、CA125检测,同时对腹膜印片进行形态学分析。结果异博定中、高剂量组能明显升高透析大鼠透析液超滤量,与对照组相比较有统计学意义(P<0.01),且异博定各组对透析大鼠CA125、腹膜间皮细胞的表面积、细胞密度等均无明显影响,相互间比较无统计学意义(P>0.05)。结论透析液中加入中、高剂量的异搏定可增加腹膜透析鼠的超滤及溶质的清除,且长期使用不会导致对腹膜间皮细胞损伤,其作用机制可能与其减少腹膜间皮细胞肥大、保护腹膜间皮细胞、改善腹膜超滤功能有关。

肝素在高糖影响大鼠腹膜间皮细胞的增殖及其表达白细胞介素-1中的作用

目的:初步观察肝素在高糖影响大鼠腹间皮细胞(Rat peritoneal mesothelial cells,RPMC)增殖及其表达白细胞介素-1,(Interleukin-l,IL-l)中的作用,从而为持续性非卧床腹膜透析(Continuous ambulatory peritoneal dialysis,CAPD)中肝素的临床应用打下一定的理论基础。方法:建立RPMC的体外培养;并用四四氮唑蓝(MTT)细胞增殖实验和酶联免疫吸附方法(ELISA),来分析肝素对高糖(3.86％葡萄糖)影响RPMC增殖及其分泌IL-l的作用。结果:3.86％葡萄糖能显著抑制RPMC的增殖,而1.25U/ml肝素能部分逆转高糖对RPMC增殖的抑制作用(P <0.01),3.86％葡萄糖能显著增加RPMC表达IL-1β,而1.25U/ml肝素能部分减少高糖增加RPMC表达IL-1β的作用(P<0.01)。结论:本文结果提示,肝素可能通过逆转高糖对RPMC的增殖抑制作用及减少高糖增加RPMC表达促炎细胞因子IL-l的作用,而延缓CAPD相关性腹膜纤维化的发生,最终有益于CAPD进行。

穿心莲内酯对大鼠腹腔粘连的抑制作用及其可能机制

目的探讨穿心莲内酯(Ad)对大鼠腹腔粘连的抑制效果及其可能机制。方法(1)将60只SD雄性大鼠分为正常对照组、模型组、地塞米松组、Ad低剂量(20 mg/kg)组、Ad中剂量(40 mg/kg)组、Ad高剂量(80 mg/kg)组,各10只。除正常对照组外,其余各组大鼠均采用摩擦盲肠法制备腹腔粘连模型;建模后48 h,各药物组给予相应的药物干预10 d。给药结束后,评估各组大鼠腹腔粘连程度,并测定血清白细胞介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,以及腹腔液中转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织生长因子(CTGF)水平。(2)另收集50只雄性SD大鼠腹腔液,制备腹膜间皮细胞后分为照组、模型组、模型+不同浓度Ad组,各10只。模型组细胞加入TGF-β1培养,模型+不同浓度Ad组细胞加入TGF-β1和相应浓度的Ad(终浓度分别为10、20、40μmol/L)培养。培养24 h后检测各组细胞内Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)蛋白、Smad7、Smad2/3及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白水平。结果(1)其他组粘连程度均重于正常对照组,地塞米松组与Ad中、高剂量组的粘连程度均轻于模型组(均P<0.05)。模型组血清IL-1β、IL-18与TNF-α水平均高于正常对照组(均P<0.05);各剂量Ad组血清IL-1β和TNF-α水平均较模型组降低;Ad中、高剂量组血清TNF-α水平均低于Ad低剂量组,Ad低剂量组、Ad中剂量组、Ad高剂量组血清IL-1β依次降低(均P<0.05)。模型组腹腔液TGF-β1和CTGF水平均高于正常对照组,Ad各剂量组的TGF-β1水平、Ad中、高剂量组的CTGF水平均低于模型组,Ad低剂量组、Ad中剂量组、Ad高剂量组的CTGF水平依次降低(均P<0.05)。(2)模型+不同浓度Ad组的Col-Ⅰ蛋白表达水平均低于模型组,且模型+10μmol/L Ad组、模型+40μmol/L Ad组、模型+20μmol/L Ad组的Col-Ⅰ蛋白表达水平依次降低(均P<0.05)。与模型组比较,模型+20μmol/L Ad组的p-Smad2/3与Smad2/3比值降低,模型+20μmol/L Ad组、模型+40μmol/L Ad组的Smad7蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。结论Ad对大鼠腹腔粘连具有良好的抑制作用,其可能通过调控Smad通路及抑制炎症反应来发挥作用。

胰腺炎大鼠腹腔积液中硫氧还蛋白表达与腹膜功能衰竭的关联机制

目的探讨胰腺炎大鼠腹腔积液中硫氧还蛋白表达与腹膜功能衰竭的关联机制。方法60只SD大鼠按照随机数字表法分为2组:对照组(n=30,不做任何干预)和实验组(n=30,通过注射牛磺胆酸钠构建大鼠急性胰腺炎模型)。模型建立成功后次日,将每组大鼠分为2批,分别采用N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP)和硫乙醇酸盐腹腔注射,并于2种炎性介质注射后0.5、2、8.0 h获取免疫球蛋白和腹腔积液。应用组织化学染色法检测β-gal的表达,分析腹膜表面的转基因MCS的面积百分比,测定腹腔积液中硫氧还蛋白表达和二硫化物氧化还原酶的活性,评估腹膜MCS炎症的严重情况。结果炎症介质注射后0.5~8.0 h,实验组胰腺炎模型大鼠MCSβ-gal阳性面积均显著低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。炎症介质注射8 h后,实验组胰腺炎模型大鼠腹腔积液中二硫化物氧化还原酶和人硫氧还蛋白活性均较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。炎症介质注射8 h后,实验组大鼠脂多糖、白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α水平较对照组增加,人硫氧还蛋白表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论胰腺炎大鼠腹腔积液中硫氧还蛋白表达和二硫化物氧化还原酶活性均显著下降,同时诱发腹膜功能衰竭,因此通过上调腹腔积液中人硫氧还蛋白的水平和二硫化物氧化还原酶活性可能有助于缓解腹膜间皮细胞的炎症。

锌离子对TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响

目的研究锌离子对转化生长因子(TGF-β1)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)转分化的影响,从而为锌离子在腹膜透析中的应用提供理论基础。方法胰蛋白酶消化法原代培养腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组:正常对照组,TGF-β1(10ng/ml作用48h),ZnSO4作用组(30μMZnSO4作用24h,再加10ng/mlTGF-β1作用48h)。采用相差显微镜观察各组细胞表型改变。应用免疫荧光、western blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Ⅰ型胶原酶(collagenI)蛋白表达。结果 TGF-β1培养48h后细胞形态由典型的上皮逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞,而ZnSO4作用组细胞形态改变明显减轻。α-SMA在正常组细胞存在少量表达,TGF-β1组荧光强度明显增强,而ZnSO4作用组荧光强度明显低于TGF-β1组。与对照组相比,TGF-β1组RPMC的α-SMA、collagenI蛋白表达明显升高,而E-cadherin蛋白表达降低。与TGF-β1组相比,ZnSO组RPMC的α-SMA、collagenI表达明显降低、E-cadherin蛋白表达增多。结论 4ZnSO4可逆转TGF-β1所致的RPMC的转分化,对腹膜透析过程中所导致的RPMC损伤具有保护作用。