竹节参齐墩果烷皂苷对RAW264-7巨噬细胞SIRT1活性影响及抗炎作用研究

目的探讨竹节参齐墩果烷皂苷(chikusetsu oleanane saponin,COS)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞的SIRT1活性影响及抗炎作用。方法Griess法测定一氧化氮(NO)释放量;免疫印迹(Western blot)法检测炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)蛋白表达;免疫荧光分析COS对细胞核因子-κB(NF-κB)和沉默信息调节因子1(silent information regulator1,SIRT1)核转运的作用。结果 COS在25~300 mg·L^(-1)与1 mg·L^(-1)LPS共培养时,对RAW264.7细胞生长无明显影响;与LPS组相比,COS能有效抑制NO释放和抑制TNF-α、IL-1β的分泌;还能抑制NF-κB的核移位,上调SIRT1的表达。结论 COS对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症具有保护作用,其保护机制可能是COS上调SIRT1表达,促进NF-κB去乙酰化作用,从而抑制NF-κB的核移位,减少TNF-α、IL-1β等炎症因子的产生。

紫金龙氯仿-甲醇组分对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的抑制作用

目的探讨紫金龙氯仿-甲醇组分对脂多糖诱导RAW264. 7细胞炎症的抑制作用。方法脂多糖刺激RAW264. 7细胞建立体外炎症模型后,加入不同质量浓度(50、100、200、400 mg/L)紫金龙氯仿-甲醇组分,ELISA法或比色法检测白介素-6 (IL-6)、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)含有量,Western blot法测定诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、环氧化酶-2 (COX-2)蛋白表达,以及核转录因子κ转抑制蛋白α(IκBα)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、c-Jun氨基端激酶(JNK)、细胞外调节蛋白激酶1/2(Erk1/2)磷酸化水平。结果紫金龙氯仿-甲醇组分可显著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、NO、PGE2释放(P <0. 05,P <0. 01),下调i NOS、COX-2蛋白水平(P <0. 01),降低p38、JNK、Erk1/2、IκBα磷酸化水平(P <0. 05,P <0. 01)。结论紫金龙氯仿-甲醇组分可有效抑制脂多糖诱导RAW264. 7细胞炎症,其机制可能与抑制NF-κB、MAPKs信号通路激活、减少炎症因子释放有关。

小叶榕叶对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO和TNF-α的影响

目的采用体外炎症模型观察小叶榕叶水提物及其不同极性萃取部位对炎症介质一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响。方法采用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞,建立体外炎症模型。采用噻唑蓝(MTT)法检测小叶榕叶水提物及其不同萃取部位对RAW264.7巨噬细胞的毒性作用;Griess法检测培养液中NO含量;采用酶联免疫试验(ELISA)法检测培养液中TNF-α的含量。结果 LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,培养液中NO和TNF-α含量显著增加(P<0.01);小叶榕叶水提物及其不同萃取部位对NO和TNF-α的释放有不同程度的抑制作用,其中水提物高、中、低浓度组对NO的抑制率分别为17.0%,30.0%,33.0%;乙酸乙酯部位中、低浓度组对NO的抑制率分别为40.0%、27.0%;水相部分低浓度组对NO的抑制率为37.0%;水提物中浓度组和乙酸乙酯部位高浓度组对TNF-α的抑制率分别为58.0%,43.5%,与LPS组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论小叶榕叶可能通过抑制NO和TNF-α释放而发挥抗炎作用,其中乙酸乙酯部位、水相部分是小叶榕叶的主要抗炎活性成分。

评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型的建立与应用

目的建立评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型,并以此评价副溶血弧菌临床分离株RIMD2210633株与其重要致病相关基因opaR基因敲除株的毒力。方法以Raw-264细胞为靶细胞,RIMD2210633株及其opaR基因敲除株为效应细胞,通过优化条件,利用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay建立细胞模型。结果以5倍于靶细胞的菌量感染靶细胞,37℃孵育1.5 h,离心所得上清稀释10倍后,加底物液避光显色10 min,反应条件最佳。opaR基因敲除后,菌株的Raw-264细胞毒性升高,并有统计学差异。结论利用副溶血弧菌标准强毒株RIMD2210633菌株建立了评价副溶血弧菌毒力的RAW-264细胞模型,并利用此平台比较了该毒株与其opaR基因敲除株的毒力,为研究副溶血弧菌的致病机制奠定了基础。

4-氨基水杨酸半乳糖苷对脂多糖诱导RAW264.7细胞产生肿瘤坏死因子-α、核因子κB p65的作用

目的观察4-氨基水杨酸半乳糖苷(4-ASA半乳糖苷)对脂多糖诱导RAW264.7细胞产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、细胞核转录因子核因子κB(NF-κB p65)的作用。方法实验设正常对照组、模型组(脂多糖组)、4-ASA半乳糖苷低、中、高剂量组,给药24 h后,酶联免疫吸附法(ELISA法)检测细胞上清中TNF-α的表达,细胞免疫法检测NF-κB p65的表达。结果模型组TNF-α的表达显著高于正常对照组(P<0.05),而4-ASA半乳糖苷10、40、160 mg/L组与模型组相比,细胞上清中TNF-α的表达显著降低(P<0.01);模型组NF-κB p65的表达显著高于正常对照组(P<0.01),细胞核与细胞质中NF-κB p65的表达在10 mg/L组显著低于模型组(P<0.05),40、160 mg/L组的表达降低更显著(P<0.01)。结论 4-ASA半乳糖苷在10、40、160 mg/L时可抑制细胞上清中TNF-α的表达,亦能抑制细胞质和细胞核中NF-κB p65的表达。

维药罗勒提取物对小鼠巨噬细胞RAW264.7生长及其胞内5-脂氧酶活性的影响

目的观察罗勒提取物对小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)生长及其胞内5-脂氧酶活性的影响。方法采用MTT比色法检测罗勒乙酸乙酯提取物或罗勒正丁醇提取物对正常RAW264.7细胞和经脂多糖刺激的RAW264.7细胞生长的影响,求出其IC50值;用罗勒乙酸乙酯提取物或罗勒正丁醇提取物分别干预经脂多糖处理的RAW264.7细胞,采用ELISA法测定并比较上清液中白三烯B4的质量浓度,求出其抑制率。结果罗勒乙酸乙酯提取物和罗勒正丁醇提取物对正常RAW264.7细胞的生长有不同程度的抑制作用,给药时间为24 h的IC50值分别为312.5μg/mL、350.9μg/mL,具有浓度依赖性;两种提取物对经脂多糖刺激的RAW264.7的生长有一定的增殖作用(P<0.05);罗勒乙酸乙酯提取物和罗勒正丁醇提取物对白三烯B4的最大抑制率分别为42.78%、38.63%,其中罗勒乙酸乙酯提取物的作用强于罗勒正丁醇提取物(P<0.05)。结论罗勒提取物体外对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞生长的最大抑制质量浓度为100μg/mL,对细胞内5-脂氧酶活性具有抑制作用。

4-氨基水杨酸对LPS诱导的RAW264.7细胞NO生成的影响

目的观察4-氨基水杨酸(4-ASA)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞一氧化氮(NO)的生成及诱生型一氧化氮合酶(iNOS)基因和蛋白表达的作用。方法采用LPS诱导RAW264.7细胞建立细胞炎症反应模型,加入不同浓度的4-ASA,采用一步法测定细胞上清中NO释放量;采用实时定量PCR法测定iNOSmRNA的表达;采用Western blot法测定目的蛋白iNOS的表达。结果 100μg/mL和1000μg/mL4-ASA能明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的分泌及iNOS基因和蛋白的表达(P<0.05)。结论 4-ASA可明显降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO的产生以及iNOS基因和蛋白的表达,从而发挥抗炎作用。

结核分支杆菌Rv2031c慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞凋亡的影响

研究结核分支杆菌Rv2031c基因对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分支杆菌Rv2031c的序列设计引物,以结核分支杆菌国际标准株H37Rv株灭活的菌液上清液为模版,扩增Rv2031c基因;克隆至慢病毒表达载体plex-EGFP中,经酶切和测序鉴定后,获得plex-Rv2031c-EGFP重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与辅助质粒共转染至293T细胞中,转染48h后收集慢病毒,并侵染RAW264.7细胞;侵染48h时收集细胞,用流式细胞术检测各试验组巨噬细胞的凋亡率;提取细胞总RNA并反转录成cDNA,PCR检测Rv2031c基因在细胞中的表达情况;同时,使用细胞裂解液提取细胞总蛋白,Western blot检测Rv2031c蛋白表达水平。结果表明,成功构建了Rv2031c的慢病毒表达载体plex-Rv2031c-EGFP;构建了过表达Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv;感染Rv2031c-lv的RAW264.7细胞的凋亡率为41.8%,而对照组EGFP-lv感染的RAW264.7细胞其凋亡率为30.0%;PCR结果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达;Western blot结果显示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7细胞中高表达。该研究成功构建了结核分支杆菌Rv2031c的慢病毒表达载体并验证了其对RAW264.7细胞凋亡的影响,为结核分支杆菌在机体内潜伏期感染的药物研究奠定了基础。

抗溃疡性结肠炎药物4-氨基水杨酸衍生物对IL-13的作用

目的观察4-氨基水杨酸衍生物对脂多糖诱导RAW264.7细胞产生IL-13的影响。方法设正常对照组、模型组(脂多糖组)、柳氮磺胺吡啶阳性对照组、4-氨基水杨酸衍生物低、中、高剂量组,给药24h后,ELISA检测上清中IL-13的含量。结果 4-氨基水杨酸衍生物在10、40、160μg/mL时均能促进IL-13的表达。结论 4-氨基水杨酸衍生物促进抑炎因子IL-13的表达。

LX A4和BML-111对巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路的作用

目的:肠道巨噬细胞定位于肠黏膜相关淋巴组织及黏膜固有层,在保持肠道稳态及免疫防御中发挥重要作用。研究脂氧素(LXs)A4及其受体激动剂BML-111对脂多糖(LPS)作用巨噬细胞RAW264.7存活和TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法:CCK-8法观察LPS对RAW264.7的毒性作用,RT-q PCR法检测细胞内TLR4、TRAF6 m RNA的表达,Western blot法检测细胞内TLR4、TRAF6和p NF-κB p65的蛋白水平。结果:在1 000 ng/m L浓度LPS组,作用6 h后,LX A4组和BML-111组对RAW264.7细胞存活率显著增高(P<0.05)。在LPS作用下,LX A4组和BML-111组对RAW264.7细胞的TLR4 m RNA及蛋白水平显著高于相对应的无LPS组(P<0.05),TRAF6 m RNA的表达均高于相对应的无LPS组(P<0.05);而LX A4组和BML-111组的TRAF6蛋白水平则低于对照组(P<0.05),高于相对应的无LPS组(P<0.05)。在LPS作用下,LX A4组和BML-111组p NF-κB p65蛋白水平低于对照组(P<0.05),而对照组又高于相对应的无LPS组(P<0.05);且LX A4和BML-111作用无差异(P>0.05)。结论:LX A4和BML-111能够抑制LPS对RAW264.7细胞的作用及TLR4/NF-κB信号通路的激活,有助减轻炎症反应;性质稳定的BML-111更有望成为IBD治疗的新契机。

竹节参醇提物对LPS诱导RAW264.7细胞炎症的保护作用

目的:观察竹节参醇提物对脂多糖(LPS)刺激小鼠单核巨噬白血病细胞RAW264.7细胞炎症保护作用的初步探讨。方法:用不同质量浓度的竹节参醇提物处理RAW264.7细胞,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性;检测LPS刺激的RAW264.7细胞一氧化氮(NO)释放量以及竹节参醇提物干预后RAW264.7细胞NO释放量;酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)分泌;聚合酶链反应(PCR)法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达;免疫印迹(Western blot)法检测胞浆胞核核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达。结果:竹节参醇提物作用RAW264.7细胞的安全范围<100 mg·L-1;LPS的用药质量浓度为1 mg·L-1;与LPS模型组相比,竹节参醇提物0.1,1,10,40 mg·L-1能有效抑制NO释放(抑制率分别为31.2%,41%,46.1%,55.2%)和抑制TNF-α,IL-1β的分泌(P<0.05或P<0.01);竹节参醇提物10,40 mg·L-1能下调LPS模型组iNOS mRNA表达且抑制NF-κB的核移位。结论:竹节参醇提物对LPS刺激的RAW264.7细胞炎症具有保护作用,其保护机制可能与调控NF-κB通路,进而抑制NO的释放,降低TNF-α,IL-1β,iNOS表达有关。

雷公藤次碱对脂多糖诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响

目的 观察雷公藤次碱（wilforine）对脂多糖诱导的小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7细胞炎症模型中炎症因子的影响。方法 采用LPS刺激生长良好的RAW264.7细胞,建立细胞炎症模型。以CCK-8法检测不同浓度雷公藤次碱对RAW264.7细胞的毒性作用;以酶联免疫吸附试验检测细胞上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）的含量;以硝酸还原酶法检测一氧化氮（NO）的含量。结果 雷公藤次碱在11.5-115 μmolL-1的浓度范围内,对RAW264.7细胞无毒性作用（p〉0.05）;脂多糖可以明显诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6和NO（p〈0.01）;雷公藤次碱可使TNF-α、IL-6和NO的释放受到抑制（p〈0.05,p〈0.01）。结论 雷公藤次碱可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,其抗炎作用与减少炎性细胞因子TNF-α、IL-6和NO的产生有关。

辐射诱导对小鼠巨噬细胞钙结合蛋白S100A8表达及调控影响的初步研究

目的探讨辐射诱导后小鼠巨噬细胞中钙结合蛋白S100A8 mRNA的表达情况及其调控机制。方法体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,按处置方法不同分为4组:A组正常培养48h;B组经10Gy射线照射后培养48h;C组用5g/ml LPS培养24h后,更换新鲜培养基继续培养24h;D组经10Gy射线照射后培养24h,然后添加5g/ml LPS继续培养24h。采用RT-PCR及定量PCR方法检测各组细胞S100A8 mRNA表达的变化。分别采用H2O2和喜树碱处理细胞,定量PCR检测S100A8 mRNA表达的变化。构建上游5′端系列报告基因表达载体并转染细胞,采用双荧光素酶法检测报告基因的表达水平。结果经γ射线或LPS刺激后,RAW264.7细胞S100A mRNA表达明显增加,二者联合作用后增加更为明显(P<0.05);H2O2处理后S100A8 mRNA表达增加,而喜树碱处理后其表达没有明显变化。单独经γ射线或LPS刺激后,报告基因的表达无明显变化,而二者联合作用后报告基因表达明显增加(P<0.05)。结论辐射诱导可促进RAW264.7细胞中钙结合蛋白S100A8 mRNA的表达。

In vitro anti-inflammatory effects of different solution fractions of ethanol extract from Melilotus suaveolens Ledeb

Background Melilotus suaveolens Ledeb （M. suaveolens Ledeb） has long been used as a folk medicine in inflammation-related therapy. This study was undertaken to determine the anti-inflammatory effect of the plant. Methods Petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction, n-butanol fraction, aqueous fraction were obtained from ethanol extract of M. suaveolens Ledeb and evaluated by high performance liquid chromatography （HPLC）. While dexamethasone （DM） was used as a positive control, the effects of different solution fractions of ethanol extract on tumor necrosis factor α （TNF-α） mRNA, cyclooxygenase 2 （COX-2） mRNA, COX-2 and nuclear factor KB （NF-KB） of LPS-stimulated RAW 264.7 cells were studied by real-time PCR, Westem blot analysis and immunocytochemical assay, respectively. Results Coumarin was one of the main ingredients in different solution fractions of ethanol extract except the aqueous fraction with no inflammatory effect. The petroleum ether fraction, ethyl acetate fraction and n-butanol fraction of ethanol extract could inhibit the production of TNF-α mRNA, COX-2 mRNA and NF-KB to some extent. Conclusions Different solution fractions of ethanol extract from M. suaveolens Ledeb had similar anti-inflammatory effect as did dexamethasone except the aqueous fraction. Coumarin was likely to be essential to the anti-inflammatory effect, and other ingredients might attribute to their different anti-inflammatory effects from the HPLC fingerprint.

慈菇多糖通过mTOR信号通路提高巨噬细胞功能

目的探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在慈菇多糖提高RAW 264.7巨噬细胞功能中的作用。方法体外培养RAW 264.7巨噬细胞,分别用ELISA和Griess法检测不同剂量慈菇多糖(5、50、500μg/m L)和香菇多糖(100μg/m L)对巨噬细胞分泌白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)的影响;用RT-PCR和Western blot检测各组巨噬细胞mTOR/第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)mRNA和蛋白表达变化。结果与对照组比较,慈菇多糖低、中、高剂量组,香菇多糖组巨噬细胞内IL-2含量[分别为(68.216±1.609)、(70.850±6.669)、(89.634±8.399)、(84.367±8.165)pg/m L]上升;慈菇多糖中、高剂量组,香菇多糖组巨噬细胞内TNF-α含量[分别为(46.989±7.895)、(70.739±7.452)、(48.125±6.757)pg/m L]上升,慈菇多糖高剂量组巨噬细胞内NO值[为(7.199±1.242)μmol/L]上升,差异均有统计学意义(均P<0.01);慈菇多糖中、高剂量组RAW 264.7细胞mTOR mRNA表达低于对照组(P<0.05);慈菇多糖高剂量组、香菇多糖组mTOR蛋白表达低于对照组(P<0.05)。结论慈菇多糖可能通过mTOR相关信号通路提高巨噬细胞功能。

解毒祛瘀滋阴方含药血清对小鼠单核巨噬细胞IRAK1信号通路表达的影响

目的通过研究解毒祛瘀滋阴方含药血清对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后小鼠单核巨噬细胞白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)信号通路的影响,探讨解毒祛瘀滋阴方对IRAK1、NF-κB炎症信号通路的影响,为其抗炎临床用药提供良好的理论支持。方法该研究拟采用体外培养小鼠单核巨噬细胞,随机分为空白组、LPS刺激组、中药血清组、空白血清组、LPS加中药血清组、LPS加空白血清组、IRAK1抑制剂组、抑制剂加LPS组、抑制剂加中药血清组及抑制剂加空白血清组。干预24 h后,采用CCK8法检测解毒祛瘀滋阴方对细胞的活力,采用ELISA法检测细胞上清中肿瘤坏死因-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量;采用免疫荧光化学染色法检测解毒祛瘀滋阴方对小鼠单核巨噬细胞中IRAK1表达的影响;采用RT-PCR法检测IRAK1、核转录因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、TNF-α及白介素6 (interleukin-6,IL-6) mRNA的表达;采用Western-blot法检测IRAK1、p-IRAK1、NF-κB蛋白水平表达;采用LC-MS检测中药组血清中的有效成分。结果中药含药血清组以2. 5%为最佳给药浓度,解毒祛瘀滋阴方能下调TNF-α和IL-6的表达及抑制IRAK1表达和NF-κB的活化(P <0. 05),中药组含药血清中检测到芍药苷和阿魏酸。结论解毒祛瘀滋阴方能抑制LPS刺激后小鼠单核巨噬细胞IRAK1、NF-κB的表达,为其抗炎临床用药提供良好的理论支持。