Evaluation of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification assays for Rapid Detection of Human Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 in Clinical Samples

A sensitive reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for human enterovirus 71 (EV71) and Coxsackievirus A16 (CVA16) infection was further evaluated. The one step reaction was performed in a single tube at 65?C for 45 min for EV71 and 35 min for CVA16. The detection limits of RT-LAMP assays for both EV71 and CVA16 were 0.1 of a 50% tissue culture infective dose (TCID50) per reaction, based on 10—Fold dilutions of a titrated EV71 or CVA16 strain. The specific assay showed there were no cross-reactions with Coxsackievirus A (CVA) viruses (CVA 2, 4, 5, 7, 9, 10, 14, and 25), Coxsackievirus B (CVB) viruses (CVB 1, 2, 3, 4, and 5) or ECHO viruses (ECHO 3, 6, 11, and 19). In parallel with commercial quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) diagnostic kits for EV71 and CVA16, the RT-LAMP assay was evaluated with 515 clinical specimens, the results showed the RT-LAMP assay and the qRT-PCR assay were in complete agreement for 513/515 (99.6%) of the specimens. Two samples with discrepant results from two methods were further verified by nested reverse transcription polymerase chain reaction (nRT-PCR) assay and sequencing to be true positives for CVA16. In conclusion, RT-LAMP assay is demonstrated to be a sensitive and specific assay and have a great potential for the rapid and visual screening of EV71 and CVA16 in China, especially in those resource-limited hospitals and rural clinics of provincial and municipal regions.

实时荧光环介导等温扩增快速分型致泻大肠埃希氏菌方法的建立

致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一种重要的食源性致病菌,该研究立足DEC目前流行率高、基层分型困难的现状,建立了快速分型5种DEC的实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。针对DEC的8段特征性毒力基因pic、aggR、lt、st、stx 1、stx2、escV、invE及大肠埃希氏菌属特异性基因uidA设计LAMP引物,优化反应体系,并对方法的分析性能及临床菌株分型效果进行了评价。结果显示,所建立的方法对pic和escV的检出限是1 ng/μL,对aggR、stx 1、invE和uidA的检出限是100 pg/μL,对lt、st和stx 2的检出限是10 pg/μL,该方法灵敏度与特异度均为100%,DEC型别间无交叉反应,对临床菌株的分型与实际结果完全一致。方法快速简便、设备要求低,借助恒温荧光读取设备可在40 min内迅速判定待检菌株是否为DEC及其致病类型,可满足各机构现场快速检测的需求。

烟草番茄斑萎病毒RT-LAMP检测体系的建立及优化

为快速检测烟草番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),基于TSWV核外壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)保守序列设计5组引物进行筛选,采用单一变量法对反应温度、时间及反应体系中dNTPs、Mg^(2+)、甜菜碱的含量和内外引物比等参数进行优化,建立烟草TSWV反转录环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测体系,并采用RT-PCR(revers transcription-polymerase chain reaction)检测方法进行平行比对试验,验证优化后RT-LAMP的特异性、灵敏性及实用性。结果表明,烟草TSWV RT-LAMP检测体系最佳引物组为TS-N-4,在25μL的反应体系中各组分最佳加入量为缓冲液2.5μL、100 mmol·L^(-1) MgSO40.5μL、10 mmol·L^(-1) dNTPs 0.5μL、10 mmol·L^(-1) FIP/BIP 1.5μL、10 mmol·L^(-1) F3/B30.5μL、10 mmol·L^(-1) LF/LB 1.5μL、5 mmol·L^(-1) Betaine 6μL、Bst 2.0 WarmStar DNA Polymerase(8000 U·mL-1)0.5μL、M-MLV酶(10000 U·mL^(-1))0.125μL、RNA(≥64.7 fg)1μL,DEPC H2O补至25μL;最佳反应温度和时间分别为58℃、60 min。优化后的RT-LAMP灵敏度是RT-PCR的1000倍,且田间样品检测结果与RT-PCR相符。建立的RT-LAMP方法特异性强、灵敏度高、操作简单,对于烟草TSWV的检测及监控有重要意义。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌

该研究针对单增李斯特氏菌的特异性基因hlyA设计引物,优化反应条件,建立实时荧光环介导等温扩增(realtime loop-mediated isothermal amplification,real-time LAMP)的检测方法,在此基础上,建立检测单增李斯特氏菌的基于淬灭基团释放环介导等温扩增检测方法(detection of amplification by release of quenching-LAMP,DARQ-LAMP),分析其特异性和灵敏度。结果表明,该方法的适宜反应条件为反应温度63℃、Bst DNA 3.0聚合酶0.32 U/μL、淬灭探针双链(quenching probe double chain,QPD)探针浓度10%、Mg2+浓度6 mmol/L;对单增李斯特菌的检测限为7.3×101copies/mL,灵敏度是普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的100倍。该方法效率高、特异性好、灵敏度高,为环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究提供参考。

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立

为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,提高检测灵敏度,实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物,采取单因素优化试验,对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg^(2+)、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化,恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析,SYBR Green I可视化显色,结果表明:SPFMV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.2μL、Betaine 7μL,64℃60 min。进一步利用SPFMV全基因组的4个片段(SPFMV-1、SPFMV-2、SPFMV-3、SPFMV-4)、SPCSV-Hsp 70和RGNNV进行特异性检验,分别建立了SPFMV和SPCSV的特异性RT-LAMP检测方法,扩增出了具有RT-LAMP的典型瀑布状条带,与凝胶电泳和SYBR Green I显色结果一致,SPFMV和SPCSV的灵敏度检测下限分别为:1×10^(-6)、1×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测灵敏度高,实现了结果的可视化。对田间甘薯苗和离体组织培养甘薯苗进行检测验证,SPFMV-RT-LAMP检测方法成功率为100%,SPCSV-RT-LAMP检测方法的成功率为95%,表明研发的SPFMV和SPCSV的RT-LAMP检测方法适用于SPFMV和SPCSV的快速检测。

基于iap基因的RT-LAMP技术检测肉类食品中单核细胞增生李斯特菌的效果评价

作者旨在探讨逆转录环介导等温扩增(reverse transcription–loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术在检测单核细胞增生李斯特菌感染的肉类食品中的效果评价。根据RT-LAMP原理,以iap基因为靶基因设计引物,检测肉制品中的单核细胞增生李斯特菌,并将该方法的特异性、灵敏度、死菌活菌鉴别效果与国标进行对比。实验获得的RT-LAMP体系最佳参数为63℃扩增60 min,反应体系中引物的最佳浓度为外引物0.4μmol/L和内引物0.8μmol/L,以及MgSO_(4)2.0 mmol/L、甜菜碱1.0 mol/L、dNTPs 2.0 mmol/L、AMV逆转录酶10 U/μL、Bst DNA聚合酶320 U/mL。该实验的灵敏度为每管7.3×10^(1)CFU,是LAMP的2倍。特异性实验显示该方法仅检测单增李斯特菌的靶基因,无假阳性。用RT-LAMP和中国国家标准GB 4789.30—2016检测市售肉样品(n=100)中单核细胞增生李斯特菌的能力相似,且RT-LAMP仅对活菌有扩增作用。死菌活菌鉴别实验显示该法可以排除肉样中死菌的干扰。经与国标方法做对比,可知RT-LAMP可作为一种有效的检测手段。

寨卡病毒核酸检测技术研究进展

寨卡病毒(ZIKV)为黄病毒科黄病毒属的一种单链RNA病毒,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,也可通过血液、性、母婴等途径传播。传播ZIKV的蚊虫在我国分布广泛,同时,随着全球化的发展,世界各国人员往来日益频繁,ZIKV在我国有潜在传播的可能性。核酸检测技术是实验室快速检测的有效手段,对预防和控制ZIKV传播具有重要意义。本文介绍了ZIKV基因组结构,并对ZIKV核酸检测的样本特点及方法进展作一综述。

南美红辣椒脉斑驳病毒RT-LAMP检测体系的建立及优化

南美红辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是一种严重危害茄科作物的正单链RNA病毒,也是云南烟草上的主要病毒之一。本研究采用单一变量法,建立并优化检测ChiVMV的反转录环介导等温扩增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)体系。对RT-LAMP的反应时间、反应温度及体系中Mg 2+、dNTPs、甜菜碱浓度和内外引物浓度比进行优化,同时用RT-PCR对优化后的RT-LAMP检测体系进行灵敏度验证。结果表明,最佳引物组为CH-CP-3,在25μL反应体系中各组分最佳加入量为:缓冲液2.5μL,MgSO 4(100 mmol/L)0.5μL,dNTPs(10 mmol/L)0.5μL,FIP/BIP(10 mmol/L)2μL,F3/B3(10 mmol/L)0.5μL,LF/LB(10 mmol/L)1.5μL,甜菜碱(5 mmol/L)5μL,Bst 2.0 WarmStar DNA Polymerase(8000 U/mL)0.5μL,M-MLV酶(10000 U/mL)0.125μL,RNA(≥50.7 fg)1μL,DEPC H 2O补至25μL;最佳反应温度及时间为63℃50 min,优化后的RT-LAMP检测结果与RT-PCR检测结果一致,且其灵敏度是RT-PCR的100倍。本研究建立的ChiVMV RT-LAMP检测方法具有快速、灵敏和操作简便等优点,为开发ChiVMV RT-LAMP检测试剂盒及其实际应用提供了重要基础。

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术，该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物，并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应，整个检测反应只需1～2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因，对60份经Real-timePCR或RT—-PCR验证阳性的血清样品检测，阳性符合率为98％。同时，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试，均与预期结果吻合。将Real-timePCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示，该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明，RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段，在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。

单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒

建立了单管逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法。针对甲型H1N1流感病毒的M基因和HA基因的保守区,设计了两组特异性引物,分别用于筛选甲型流感病毒及鉴定甲型H1N1流感病毒。对反应体系中的关键因素进行优化,反应结果可直接通过浊度或者SYBR GreenⅠ荧光进行判定。本方法最低可检测到10拷贝/管的甲型H1N1流感病毒。为验证方法的可行性,对30例临床样本进行了检测,与美国疾病控制与预防中心(CDC)的TaqMan方法进行对比,检测的灵敏度和特异性分别为92%和100%。本方法实现了单管快速检测甲型H1N1流感病毒,为甲型H1N1流感病毒的现场检测提供了新方法。

白斑综合症病毒实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

研究利用ESE-Quant tube scanner检测平台,建立了一套基于环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的实时荧光检测方法,用于白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的检测;并在此基础上,与巢式PCR、Real-time PCR和其他已发表的4种LAMP方法在检测灵敏度、实际应用方面进行比较。结果显示,研究建立的实时荧光LAMP检测方法在63℃恒温反应30min可检测到最低为105倍稀释的基因组DNA模板,与Real-time PCR检测方法的灵敏度相当,高于巢式PCR和其他已发表的4种LAMP方法的检测灵敏度;而且特异性较好,与传染性皮下及造血组织坏死病毒等5种常见对虾病原DNA均无交叉反应。通过构建质粒进一步进行灵敏度测试显示,本研究建立的实时荧光LAMP检测方法最低检测限度为24个拷贝质粒DNA,检出时间亦为30min。通过对66份待检样品的检测结果显示,实时荧光LAMP检测方法的检出阳性率为7.57%,准确率为100%,高于其他WSSV的检测方法。因此,研究建立的WSSV实时荧光LAMP检测方法,操作简单,反应速度快,特异性好,灵敏度高,成本低廉,可以直观、实时地观察反应的进行情况,适合对虾养殖现场及诊断实验室的WSSV快速检测。

马铃薯卷叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速准确检测马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)的方法,本研究以PLRV CP(coat protein,CP)基因ORF3保守序列为靶标,建立了PLRV反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测体系,并对建立的RT-LAMP检测体系的特异性、灵敏度、实际应用效果进行评估。结果表明,建立的PLRV RT-LAMP检测方法,在62℃恒温下扩增50 min,扩增产物中加入双链嵌合荧光染色(SYBR GreenⅠ),阳性样品颜色变为绿色,阴性样品颜色仍为褐色,可直接目测判断待检测样品是否感染PLRV。该方法只特异性检测PLRV,不与马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯M病毒(PVM)等其他5种马铃薯主要病毒发生交叉反应。此外,建立的PLRV RT-LAMP检测方法的灵敏度较反转录PCR(RT-PCR)方法高100倍。田间样品检测验证,该方法与标准RT-PCR方法符合率达100%。本研究建立的以SYBR GreenΙ为颜色指示的PLRV可视化检测RT-LAMP方法,特异、灵敏、便捷,成本低,可满足科研、基层单位对该病毒快速诊断和检测的需要。

豇豆重花叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

豇豆重花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus,CPSMV)是我国进境植物检疫性有害生物,本研究根据CPSMV的外壳蛋白基因序列设计引物,以期建立CPSMV的反转录-环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法。条件优化后,建立了CPSMV的RT-LAMP方法,该方法可将CPSMV与同属其他病毒准确区分,具有良好的特异性。灵敏度试验显示,RT-LAMP比普通RT-PCR灵敏度高10倍。说明本研究建立的RT-LAMP方法适用于CPSMV的快速、特异和灵敏的检测。

逆转录环介导等温扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用

目的建立逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)快速检测诺如病毒的方法。方法采用逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)扩增诺如克病毒特异性基因,并与RT-PCR方法比较。结果与RT-PCR技术相比,RT-LAMP法更加简便快速,能够在等温条件下进行,特异性好,具有更高的灵敏性。结论RT-LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测诺如病毒快速简便的新方法。

LAMP实时浊度法快速检测转基因玉米MON810

LAMP实时浊度法是采用环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)技术通过实时浊度仪实时检测反应过程中所产生的白色沉淀,从而实现对扩增全过程的监控,弥补了显色法只能观看反应终点的缺陷,使引物筛选和反应体系的优化有数据可依。本研究以转基因玉米MON810为研究对象,针对外源基因苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白CryIA(b)与内源基因边界序列设计6条特异性引物,通过实时浊度法在63℃的恒温条件下完成检测,对检测的灵敏度、特异性、稳定性进行了评价。建立了转基因玉米MON810的LAMP实时浊度检测方法,该方法最低检出限为0.5%,与LAMP显色法和实时荧光PCR法进行结果比对,符合率为100%,经评价具有特异性高、稳定性强、准确简便等优点,非常适合转基因玉米MON810的快速检测,有较好的应用价值。

鸭Ⅰ型肝炎病毒一步法RT-LAMP可视化快速检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的鸭I型肝炎病毒（ DHV I） VP1基因的高度保守序列,设计了特异性的引物,建立了一种灵敏、特异、高效的可视化体外环介导等温扩增方法（ RT-LAMP）。结果表明,该方法的灵敏性可达到10 fg,是常规一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反应可以在1.0～1.5 h内完成,并可以直接通过肉眼观察颜色进行结果判定,该方法对其他鸭常见的病原体检测结果全部为阴性,该方法的建立为下一步研制鸭I型肝炎病毒的RT-LAMP快速检测试剂盒打下基础。

新型鸭呼肠孤病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立适于基层实验室快速检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的一步反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法。基于新型鸭呼肠孤病毒S3基因的6个保守区域设计了4条LAMP引物,利用Bst DNA聚合酶在63℃恒温保持45 min即可完成反转录和扩增反应,由此建立了RT-LAMP检测方法。该方法具有良好的特异性,除NDRV外对其他6种常见鸭病的检测结果均为阴性。该方法对病毒RNA的最低检出量为0.1 pg,是常规RT-PCR方法的100倍。临床应用结果表明,该方法与病毒分离鉴定方法的符合率为98%,而且对仪器的要求低,适于基层实验室和现场检测。