肝癌患者血清中lncRNA HOTAIR表达与临床病理特征的相关性及诊断价值

目的分析血清长链非编码RNA HOX转录反义RNA(IncRNA HOTAIR)在肝癌患者中的表达与临床诊断意义。方法选取100例肝癌患者为研究对象,并将其纳入肝癌组,另选取同期收治的80例肝硬化患者纳入肝硬化组,同时选取同期行体检的75例健康体检者纳入对照组。采集3组5 ml静脉血,以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测对比3组血清IncRNA HOTAIR相对表达量。同时,收集肝癌患者的年龄、性别等一般资料,分析血清IncRNA HOTAIR与其临床病理特征的关系;另外绘制受试者工作曲线(ROC),分析血清IncRNA HOTAIR在肝癌中的诊断效能。结果肝癌组的IncRNA HOTAIR相对表达量[(2.53±0.58)]高于肝硬化组[(0.81±0.25)]与对照组[(0.20±0.05)],差异有统计学意义(P<0.05)。IncRNA HOTAIR表达与肝癌患者的TNM分期、血管侵犯、肝外转移有关,差异有统计学意义(P<0.05);IncRNA HOTAIR表达与患者的年龄、性别、肿瘤数目无关,差异无统计学意义(P>0.05)。ROC结果显示:血清IncRNA HOTAIR诊断肝癌的AUC为0.901(95%CI:0.852~0.949),具有较高的诊断价值。结论肝癌患者血清内IncRNA HOTAIR呈高表达,其表达水平与患者TNM分期、血管侵犯、肝外转移相关,可能参与肝癌的发生、发展,在肝癌中具有较高的临床诊断意义。

实时荧光定量RT-PCR分析非小细胞肺癌SATB1的表达和临床病理意义

目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织及正常肺组织中SATB1 mRNA的表达,分析SATB1基因表达与临床病理参数的相关性。结果癌组织中SATB1 mRNA表达量为正常组织13倍,两者差异显著(P<0.001),其中有、无转移组分别为正常组织23.63倍和5.57倍。结论SATB1 mRNA的表达水平可能与非小细胞肺癌发生发展及淋巴转移有关,有望成为判断非小细胞肺癌预后的一个指标。

六味地黄汤及其拆方对正常小鼠和SAMP8胸腺淋巴细胞分化相关基因表达的影响

目的:研究六味地黄汤及其"三补(SB)"、"三泻(SX)"拆方对正常小鼠和快速老化模型小鼠(SAMP8)胸腺淋巴细胞分化相关的Notch信号转导通路基因表达的影响。方法:以荧光实时定量PCR方法检测Notch1、PS1、PS2、HES1等基因表达的变化。结果:口服LW(5、10、20g/kg)可明显促进正常小鼠胸腺细胞PS2、HES1基因的表达;口服LW(10g/kg)及其SB、SX拆方,可不同程度地降低SAMP8的PS2、HES1基因表达水平。结论:LW可增强正常的小鼠胸腺细胞Notch信号强度;对免疫老化的SAMP8,LW能够降低胸腺细胞Notch信号强度。

应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

目的探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材,其中血液(斑)、唾液(斑)、精液(斑)各10份,分别进行常规检验法和分子生物学方法,通过DNA-RNA共提取技术,将其中的mRNA运用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术反转录成cDNA,根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物,进行实时荧光定量PCR扩增,通过熔解曲线测定不同的熔解温度(Tm)和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液(斑)的Tm值为(84.5±0.2)℃,片段长度177 bp;唾液(斑)的Tm值为(76.9±0.3)℃,片段长度134 bp;精液(斑)的Tm值为(88.5±0.2)℃,片段长度294 bp。结论与常规检验法比较,联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠,可应用于日常法医物证检验。

贵州省及部分周边地区牛博尔纳病病毒感染的情况调查

目的探讨贵州省及周边地区牛群博尔纳病病毒(BDV)感染状况。方法采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测了120例牛的外周血单个核细胞中的BDV p24基因片段。结果牛外周血单个核细胞(PBMCs)中BDVp24基因片段阳性率均为4.17%。牛BDV p24基因片段的测序结果与GeneBank提供的标准病毒株比较,同源性96.51%～97.67%;有2个位点出现一致性沉寂突变(nt1675C-T,nt1678T-C突变率为2%);与马的Strain V病毒株比较,有3个位点出现一致性沉寂突变(nt1650T-C,nt1671C-T,nt1674C-T突变率为3%);与H1766病毒株比较,有2个位点出现一致性沉寂突变(nt1675C-T,nt1678T-C突变率为2%);与He80/FR病毒株比较,在3个位点出现一致性沉寂突变(nt 1660T-C,nt 1669A-G,nt 1672C-T突变率为3%);但它们所编码的氨基酸没有改变。结论贵州及湖南省部分地区牛群中存在BDV自然感染,可能是BDV流行区域之一;人感染BDV可能具有潜在的动物源性。

荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应检测大鼠死后肾mRNA

目的探讨荧光半定量逆转录-聚合酶链式反应(fluorescencesemi-quantitativereversetranscrip-tase-polymerasechainreaction,RT-PCR)技术检测大鼠死后不同时间肾3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA含量变化对死亡时间(postmorteminterval,PMI)推断的应用价值。方法28只大鼠断颈处死后置于20℃温控系统内,利用荧光标记半定量RT-PCR技术检测大鼠肾GAPDHmRNA在死后48h内相对表达量的变化情况。结果在死后即刻至40h内大鼠肾均可检测出GAPDHmRNA,且其扩增产物呈规律性下降。结论荧光半定量RT-PCR技术检测大鼠死后肾GAPDHmRNA含量变化对PMI推断具有一定的应用价值。

实时荧光定量RT-PCR检测结直肠癌中外周血端粒酶逆转录酶mRNA的表达及其临床意义

目的:建立外周血端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达量检测的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测结直肠癌患者hTERT mRNA的表达并探讨其对结直肠癌微转移的诊断价值.方法:用实时荧光定量RT-PCR技术检测53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本hTERT mRNA表达情况,分析其表达与肿瘤临床病理特征的关系并应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA检测对结直肠癌的诊断价值.结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA表达水平显著高于正常对照组(t'=7.953,P<0.05),其表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(t'/t=2.334,2.149,2.460,均P<0.05).hTERT mRNA诊断结直肠癌的ROC曲线下面积0.91,诊断界值为Ct≤32.结论:应用实时荧光定量RT-PCR技术克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点;外周血hTERT mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物.

WT1(17AA+)剪接变异体在白血病中表达

目的:探讨不同白血病细胞株及不同亚型急性白血病患者原代骨髓细胞中WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平。方法:建立实时定量RT-PCR方法,检测K562、SHI、Jurkat、NB4、NB4／WTIA、NB4／WTID等白血病细胞株及79例初诊急性白血病患者原代骨髓细胞中WT1基因和WT1(17AA+)剪接变异体表达水平,并计算WT1(17AA+)／WT1比值。结果:白血病细胞株K562、SH1、NB4、NB4／WT1A、NB4／WT1D中WT1基因表达水平较Jurkat、U937高2～3个对数级,且K562和NB4细胞株中WT1表达以WT1(17AA+)剪接变异体优势表达。79例急性白血病患者原代骨髓细胞中WT1总体表达水平在0．03-34．17之间,中位数为1．02,明显高于23例对照非白血病患者(P<0．001),其WT1(17AA+)／WT1比值在0．30～0．93之间,中位数为0．62,WT1(17AA+)剪接变异体表达在不同亚型急性白血病之间无统计学差异(F=0．152, P=0．979)。结论:高表达WT1的白血病细胞株及白血病患者骨髓细胞中WT1基因以WT1(17AA+)剪接变异体优势表达,且WT1(17AA+)剪接变异体表达在不同亚型急性白血病之间无明显统计学差别。

中药有效成分对HepG2细胞中CYP相关基因表达的影响

目的观察8种中药有效成分对细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)1A1,2E1,3A4和3A5基因表达的影响。方法采用实时定量PCR技术检测HepG2细胞中各CYP mRNA的表达。结果黄芩苷、黄芩素和青蒿素在不同浓度下均明显地诱导CYP1A1的表达。与黄芩苷和黄芩素相比,青蒿素对CYP1A1的诱导作用较弱。七叶皂苷钠、黄芩素和青蒿素能明显诱导CYP3A4的表达。结论HepG2细胞可作为CYP诱导剂的体外筛选模型。黄芩苷、黄芩素、青蒿素和七叶皂苷钠对CYP1A1或CYP3A4的诱导作用,为中西药代谢性相互作用及毒理学研究提供了实验依据。

大鼠TGF-β1 mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

目的 建立检测大鼠TGF- β1mRNA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT- PCR方法。方法 摸索SYBRGreenⅠ工作液的配制方法,筛选PCR反应液,优化反应中引物和MgCl2 的浓度,以actin为对照,建立大鼠TGF -β1mR NA表达水平的SYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR方法并检测大鼠肾皮质TGF -β1mRNA表达水平。结果 SYBRGreenⅠ工作液,4 0倍水溶液稳定性好,最佳反应稀释度为1∶1 0 0 0 0。大鼠TGF β1表达水平的SYBRGreen荧光定量PCR方法,TGF- β1和actin的最佳MgCl2 反应浓度分别为2 5mM和3 5mM ,引物浓度分别为0 . 8μM和0. 5μM ,特异扩增产物的熔解温度分别为88 1和88 .6℃,因此选择在85℃时收集荧光信号。正常大鼠TGF- β1的Ct值在2 9 0 3,actin的Ct值在2 4 .86 ,扩增效率分别为0 . 995和1 . 0 8。结论 通过优化反应条件和特异性分析,成功地建立了特异、敏感的大鼠TGF- β1mRNASYBRGreenⅠ荧光定量RT PCR。SYBRGreenⅠ荧光定量PCR快速、敏感、特异、经济,可以满足临床和科研的需要。

结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶mRNA和MUC1 mRNA的检测及其临床意义

背景:传统影像学检查和血清肿瘤标记物检测对结直肠癌微转移的诊断价值有限。目的:检测结直肠癌患者外周血人端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA和MUC1 mRNA表达,探讨两者对结直肠癌微转移的诊断价值。方法:收集53例结直肠癌患者和21名健康人的外周血标本,以实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达,分析两者表达与肿瘤临床病理特征的关系。应用接受者操作特征曲线(ROC曲线)分析hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测对结直肠癌的诊断价值。结果:结直肠癌组外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA表达率和表达水平显著高于正常对照组(P<0.05),两者表达与肿瘤淋巴结转移、血行转移和TNM分期相关(P<0.05)。hTERT mRNA、MUC1 mRNA和两者联合检测诊断结直肠癌的ROC曲线下面积分别为0.806、0.778和0.861,诊断界值为Ct<32。结论:外周血hTERT mRNA和MUC1 mRNA可作为诊断结直肠癌微转移的标记物,以实时荧光定量RT-PCR联合检测两项指标优于单项检测。

蛛网膜下腔出血大鼠模型脑组织中神经肽YmRNA表达的变化

目的检测蛛网膜下腔出血大鼠模型脑组织中神经肽YmRNA表达的变化,为进一步研究防治蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛提供线索。方法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型,并设生理盐水模型和假手术模型对照,用RT-PCR方法半定量检测各模型分别存活15、30min和1、4、8、12、24、48h时纹状体、大脑皮层、下丘脑中神经肽YmRNA的含量。结果蛛网膜下腔出血后脑组织中神经肽YmRNA的含量显著升高;随时间的推移,含量逐渐下降,但仍显著高于同一时点的生理盐水组和假手术组。结论蛛网膜下腔出血后脑组织中神经肽YmRNA的含量显著升高,这可能在诱发脑血管痉挛中起重要作用。

多重实时定量PCR检测BCR—ABL mRNA方法的建立

目的建立一种快速、可靠的实时定量PCR（RQ-PCR）检测BCR-ABL mRNA的方法。方法应用LightCycler技术，设计在同一PCR反应管内可扩增b3a2、b2a2、ela2几种常见的BCR-ABL转录本和b3a3、b2a3等少见转录本，并对RQ-PCR主要要素进行优化，评价优化后RQ-PCR的敏感性、特异性和可靠性。结果建立的RQ-PCR方法可检出10^3健康人单个核细胞中的1个K562细胞，最低可检出100个拷贝BCR—ABL分子。BCR—ABL和ABL的循环域值（C1）值（拷贝数）批内变异系数分别为0．68％（12．93％）和0．59％（8．60％），批间变异系数分别为1．14％（18．89％）和1．01％（12．72％）。结论RQ-PCR可作为评价慢性粒细胞白血病（CML）疾病进展、预后判断和骨髓移植后微量残留白血病监测的灵敏、可靠的方法。

中性粒细胞趋化因子在急性胰腺炎相关急性肺损害中的作用

目的:探讨中性粒细胞趋化因子(CINC)在急性胰腺炎相关的急性肺损害(ALI)中的作用.方法:分别采用ip雨蛙肽和胰胆管逆行注射50g/L牛磺胆酸钠建立大鼠轻症、重症急性胰腺炎模型.84只SD大鼠随机分为雨蛙肽组、生理盐水组、牛磺胆酸钠组和手术对照组.分别检测各组不同时间点血清淀粉酶、肺干湿重比和肺组织病理学改变,用免疫组织化学法和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺组织中CINC蛋白和CINCmRNA表达的变化情况.结果:雨蛙肽组各时间点CINC蛋白和CINCmRNA的表达与生理盐水组无明显差异(P>0.05);牛磺胆酸钠组与手术对照组相比,血清淀粉酶、肺干湿重比显著升高(P<0.05),术后1h肺组织CINCmRNA的表达开始升高(1h:0.23±0.07vs0.07±0.04,P<0.05;3h:0.36±0.07vs0.06±0.04,P<0.05;6h:0.56±0.07vs0.09±0.05,P<0.01;12h:0.49±0.09vs0.11±0.03,P<0.01),术后3h开始有CINC蛋白的表达,随着时间的延长表达逐渐增强,且与肺组织的病理改变呈正相关.结论:CINC可能在胰腺炎相关的急性肺损害中起了重要的作用.

AFP、h-TERT及VEGF基因在肝细胞癌患者外周血中的诊断价值

目的:探讨肝细胞癌(HCC)患者外周血中甲胎蛋白(AFP)、端粒酶逆转录酶(h-TERT)及血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达及联合检测对诊断HCC的应用价值.方法:应用荧光定量PCR(FQ-PCR)对40例HCC、20例肝外良性疾病及10例正常体检人群的外周血AFP mRNA、h-TERT mRNA及VEGF mRNA的表达量进行检测.结果:3种指标在HCC患者中阳性率分别为77.5%、85%及72.5%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).且AFP mRNA、VEGF mRNA的阳性表达与HCC患者血清AFP水平无关(P>0.05),h-TERT mRNA与患者血清AFP水平存有相关性(P=0.01);3种指标与HCC患者的TNM分期高度相关(P<0.01).AFP mRNA在诊断HCC特异性较高,而AFP mRNA和h-TERT mRNA联合检测效果更好(敏感度92.%,特异度80%).结论:3种指标对诊断HCC均能起到良好的参考作用,联合检测AFP mRNA及h-TERT mRNA能增加诊断HCC的敏感度及特异度.

黄酮与黄酮醇类化合物对HepG2细胞中CYP1A1mRNA表达的影响

目的观察15种黄酮与黄酮醇类化合物对细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)1A1基因表达的影响。方法采用实时定量PCR技术检测HepG2细胞中各CYP1A1mRNA的表达。结果黄酮、6-羟基黄酮、槲皮素、黄芩素、野黄芩苷、野黄芩素和白杨黄素是CYP1A1的强诱导剂,50uM浓度时诱导超过10倍;黄芩苷是中等程度诱导剂,诱导倍数为7.68;桑黄素、木犀草素、汉黄芩素和山萘酚是CYP1A1弱诱导剂,诱导倍数在2-3倍左右。而7-羟基黄酮、漆黄素、芹菜黄素是CYP1A1的弱抑制剂,抑制倍数在2-3倍。结论黄酮与黄酮醇类化合物对CYP1A1的诱导作用存在很大的差异,其诱导作用的强弱与其结构有关。黄酮与黄酮醇类化合物对CYP1A1表达的强诱导作用,能加速一些前致癌物转化为致癌物,我们的研究为黄酮制剂的安全性提供了实验数据。

VEGF165b在结直肠癌组织中的差异表达及其意义

目的:研究血管内皮生长因子165b(vascular endothelial growth factor 165b,VEGF 165b)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)组织及其配对的正常黏膜组织中的表达情况,探讨其与结直肠癌发生与发展的关系.方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,real-time qRT-PCR)分别检测20对结直肠癌组织及其配对的正常肠黏膜组织中VEGF 165b mRNA的表达情况;运用统计学方法对结直肠癌组织与正常黏膜组织、浆膜内侧与浆膜外侧组织、无淋巴结转移与有淋巴结转移组织以及TNM分期Ⅱ期与Ⅲ期组织中的VEGF 165b mRNA的表达情况统计与分析.结果:VEGF l65b在结直肠癌组织中的表达明显低于正常黏膜组织的表达,统计具有显著性差异(P=0.006);在浆膜内侧与浆膜外侧组织、无淋巴结转移与有淋巴结转移组织以及TNM分期Ⅱ期与Ⅲ期组织中的VEGF 165b mRNA的表达无明显差别,统计无显著性差异(P>0.05).结论:VEGF 165b在结直肠癌组织中的表达明显低于正常黏膜组织的表达,提示VEGF165b可能具有抗血管生成、抑制肿瘤生长的作用,为结直肠癌的诊断、治疗和预后提供新的靶点.

实时荧光定量PCR技术检测食管鳞癌c-myc mRNA的表达

目的探讨c-myc mRNA表达与食管鳞癌发病的关系。方法采用实时荧光定量PCR法检测24例食管鳞癌患者食管鳞癌组织和正常食管鳞状上皮组织、癌旁食管鳞状上皮组织中c-myc mRNA的表达。结果食管鳞癌组织与癌旁食管鳞状上皮组织c-myc基因的表达量相近,二者均明显高于正常食管鳞状上皮组织(P<0.05)。结论c-myc基因在食管鳞状上皮癌变过程的早期阶段起重要作用。

外周血中hTERT及MUC4基因的表达在胰腺癌诊断中的意义

目的:探讨人端粒酶逆转录酶(human Telomerase reverse transcriptase,hTERT)及黏蛋白4(mucin4,MUC4)基因在胰腺癌患者外周血中的表达及临床意义.方法:采用实时荧光定量PCR方法检测hTERT mRNA和MUC4 mRNA在胰腺癌患者及正常人外周血中的表达,对hTERT mRNA和MUC4 mRNA的检测结果进行评价分析.结果:胰腺癌组外周血中hTERT mRNA,MUC4 mRNA表达水平分别为(7.95±5.46,38.25±25.07)显著高于对照组(0.92±1.07,4.37±5.96).差异具有显著统计学意义(均P<0.05).hTERT mRNA和MUC4 mRNA均与肿瘤的淋巴结转移、周围器官或远处转移及TNM分期相关(hP分别为0.036、0.027、0.019,均P<0.05;MP分别为0.041、0.022、0.017,均P<0.05).结论:外周血中hTERT mRNA和MUC4 mRNA的表达与胰腺癌侵袭及转移密切相关,可作为诊断胰腺癌的标志物.

肺癌外周血CK19mRNA表达的临床意义

目的:应用荧光定量RT-PCR(Fluorogenic quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测肺癌外周血中的表达情况,并探讨其表达的临床意义。方法:用荧光定量RT-PCR方法检测67例肺癌患者外周血CK19 mRNA表达。结果:66例肺癌患者外周血中CK19mRNA检测阳性35例,阳性率53.0%,统计结果显示外周血CK19mRNA的表达与性别、年龄、病理类别、临床分期无关,在不同分化程度、淋巴结转移状态间有显著差异。结论:CK19mRNA可作为RT-PCR法检测肺癌患者外周血微转移的分子标志物,有助于早期诊断肺癌血行转移,指导临床治疗。