hFXYD6反义核酸对胆管癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响

目的:研究hFXYD6基因反义核酸对人胆管癌QBC939细胞体外增殖和侵袭能力的影响.方法:构建hFXYD6基因反义核酸真核表达载体pcDNA3.1(-)/hFXYD6(-)并转染人胆管癌QBC939细胞,同时设pcDNA3.1(-)空载体对照组和空白对照组.SYBR GreenⅠ荧光定量RT- PCR和免疫组化分别检测hFXYD6 mRNA及蛋白表达;MTT、平板克隆形成实验检测细胞体外增殖活性:流式细胞仪检测细胞周期;Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力.结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞hFXYD6 mRNA及蛋白表达量降低;细胞群体倍增时间增加(46.8 h vs 34.5 h,35.3 h),细胞克隆形成率降低(24.3%±5.3% vs 61.0%±8.5%,58.0%±5.6%,P<0.001);细胞周期中G1期细胞比例明显升高(66.4%±2.9% vs 33.5%±2.3%,39.4%±3.7%,P<0.001),S期比例明显减少(18.6%±1.6% vs 36.2%±2.1%,34.1%±1.6%,P<0.001);Transwell侵袭小室中24 h穿膜细胞数无显著改变.空白组和空载组细胞间均无明显差异.结论:hFXYD6反义核酸抑制人胆管癌QBC939细胞体外增殖能力,但对其侵袭能力无明显作用.

Ph^+/bcr-abl^+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph+ /bcr abl+ 急性淋巴细胞白血病 (ALL)患者的微小残留病变 (MRD)的简便而灵敏的方法 ,对 84例初治ALL患者和其中的缓解期患者的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT PCR检测。结果表明 ,缓解期患者骨髓中不存在Ph′染色体 ,巢式RT PCR方法检测到 11/ 14例缓解期患者存在MRD(bcr abl融合基因 ) (阳性率 78 5 7% ) ,而流式细胞术检测到 5 / 14的缓解期患者阳性 (阳性率 35 71% )。巢式PCR的灵敏度达到 10 -6- 10 -7水平 ,流式细胞检测的灵敏度达到 10 -4- 10 -5水平。结论 :Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏 ,而巢式RT PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高 ,且更易于开展应用。

反义人钙周期素结合蛋白编码基因转染对胃癌细胞多药耐药性的影响

目的 研究hCacyBP编码基因在胃癌多药耐药机制中的作用。方法 采用Northern杂交 ,检测SGC790 1细胞及SGC790 1/ADR细胞中hCacyBPmRNA表达水平的差异。将hCacyBPcDNA克隆到 pcDNA3.1中 ,构建反义核酸真核表达载体 pcDNA3.1/hCacyBP ,并转染耐阿霉素人胃癌细胞 ,用RT PCR检测转染细胞中hCacyBPmRNA水平的变化。用MTT比色法和FCM ,分别检测SGC790 1/ADR细胞、pcDNA3.1/hCacyBP 和 pcDNA3.1分别转染的SGC790 1/ADR细胞 ,对ADR的药物敏感性和胞内ADR的蓄积浓度。结果 Northern杂交证实 ,SGC790 1/ADR细胞中hCacyBPmRNA表达的水平显著高于SGC790 1细胞。成功地构建了pcDNA3.1/hCacyBP 。以 pcDNA3.1/hCacyBP 转染的SGC790 1/ADR细胞中hCacyBPmRNA的表达水平 ,显著低于空载体转染及未转染的SGC790 1/ADR细胞。MTT检测表明 ,转染pcDNA3.1/hCacyBP 的细胞 ,对ADR的药物敏性较空载体转染及未转染的SGC790 1/ADR细胞有所增高 ,生存率较后两者为低。FCM显示 ,转染 pcD NA3.1/hCacyBP 的SGC790 1/ADR细胞、转染 pcDNA3.1及未转染的SGC790 1/ADR细胞内ADR的蓄积浓度 ,分别为6 .72、5 .6 2和 5 .5 4。结论 hCacyBP碥码基因对胃癌细胞的MDR有一定的影响 。

种植于硅橡胶膜上的大鼠纤维环细胞的表型特征研究

目的:比较种植于硅橡胶膜或塑料培养板的大鼠纤维环细胞的表型特征.方法:利用倒置相差显微镜及透射电镜观察种植于不同基质的大鼠纤维环细胞形态的变化;利用甲苯胺蓝染色观检测蛋白多糖的表达情况;通过RT-PCR法检测Ⅰ,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA的表达情况;采用流式细胞术观察细胞表面整合素β1的表达情况;同时检测了纤维环细胞在硅橡胶膜上的黏附情况.结果:种植于不同基质的纤维环细胞形态学观察无明显差别;在两种基质上的纤维环细胞甲苯胺蓝染色无差异;Ⅰ,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA及细胞膜整合素β1的表达亦无明显差异;纤维环细胞可以黏附于硅橡胶膜上生长.结论:种植于硅橡胶膜上的纤维环细胞表型特征无改变,为进一步研究力学刺激对纤维环细胞的影响提供实验基础.

TGF-β1、SMAD3、CDC25A、CDC25B在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

目的研究转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF—β1）、SMAD3、细胞分裂周期25（cell division cycle25，CDC25）A、B在食管癌中的表达情况及其异常表达与食管癌发生、发展之间的关系。方法利用逆转录聚合酶链反应方法检测44例同个体食管癌、癌旁组织、食管正常黏膜组织中TGF-β1、SMAD3、CDC25A、CDC25B mRNA的表达，采用流式细胞术检测同组38例食管癌和20例食管正常黏膜组织中SMAD3、CDC25A、CDC25B蛋白的表达。结果CDC25A、CDC25B在食管正常黏膜组织、癌旁组织、食管癌中表达呈逐渐增高趋势，TGF-β1、SMAD3呈逐渐下降趋势。结论TGF-β1、SMAD3、CDC25A、CDC25B的异常表达可能是引起食管癌发生和发展的因素，食管癌变早期即已出现，可以作为早期诊断的指标。CDC25A、CDC25B、SMAD3、TGF-β1，mRNA的表达异常与食管上皮癌变密切相关，有望为靶点指导抗肿瘤的基因治疗。

雷公藤红素对内皮细胞E-selectin和ICAM-1及CD31表达的实验研究

目的通过研究雷公藤红素对细胞因子表达的影响探讨其体外抑制血管生成的机制。方法应用RT-PCR检测一定浓度雷公藤红素作用下的内皮细胞株ECV304 E-selectin和ICAM-1的表达,采用流式细胞仪检测不同浓度雷公藤红素作用下内皮细胞株ECV304表面CD31的表达。结果RT-PCR的结果表明,经过雷公藤红素处理后,内皮细胞株ECV304 ICAM-1的表达明显地降低,而E-selectin和CD31并未见表达。结论雷公藤红素在体外可能通过影响内皮细胞粘附分子ICAM-1等的表达,从而抑制血管生成。

Survivin在喉癌组织中的表达及其与细胞凋亡的相关性

目的:研究Survivin基因在喉癌发生发展中的作用。方法:应用RT-PCR及流式细胞术检测42例喉癌组织细胞中survivinmRNA、蛋白及细胞凋亡率(AP)。结果:SurvivinmRNA及蛋白在喉癌组织中尤其是Ⅲ、Ⅳ期中高度表达;在survivin表达组中AP明显降低,且survivin蛋白定量与AP呈负相关。结论:Survivin基因可能通过抑制细胞凋亡参与了喉癌的发生、发展,提示喉癌的高侵袭性和预后不良。

循环肿瘤细胞检测的研究新进展

循环肿瘤细胞的检测有助于发现早期肿瘤患者的微转移、重新确定临床分期、监测术后患者肿瘤复发与转移、评估预后、选择个体化的治疗策略。本文综述了近年来免疫细胞化学法、逆转录聚合酶链反应、流式细胞术、免疫磁珠富集检测法检测循环肿瘤细胞的研究新进展。

类风湿关节炎患者外周血单核细胞Toll样受体2的表达及意义

目的观察类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞Toll样受体2(TLR2)的表达变化与疾病活动程度和临床指标的关系,探讨RA的发病机制。方法27例活动期RA患者、20例非活动期RA患者及18名正常对照,采用流式细胞术检测外周血单核细胞表面TLR2的表达,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内TLR2 mRNA的表达。结果活动期RA患者外周血单核细胞TLR2的表达水平显著高于缓解期RA患者及正常对照,而缓解期RA患者TLR2与正常对照相比,差异无统计学意义。RA患者外周血单核细胞TLR2的表达与疾病活动评分(DAS)、血清C反应蛋白(CRP)及血沉(ESR)相关,而与类风湿因子(RF)及抗环瓜氨酸肽(抗CCP)抗体无明显相关性。结论活动期RA患者外周血单核细胞TLR2表达增高,且TLR2的表达与疾病活动指标密切相关。活动期RA患者存在着固有免疫系统的活化,TLR2的高表达可能促进了外周血单核细胞的活化。

溃疡性结肠炎大鼠淋巴细胞异常归巢与结肠病变

目的探讨实验性溃疡性结肠炎大鼠淋巴细胞异常归巢与结肠炎症的关系。方法60只 SD 大鼠随机分为对照组、模型组及淋巴细胞归巢干预组(SLC 抗体干预),每组20只,观察、比较不同组别结肠黏膜炎症,组织细胞因子的变化,逆转录(RT)-PCR 半定量法检测、比较结肠组织中次级淋巴组织趋化因子(SLC)及淋巴细胞归巢受体 CCR7的表达;流式细胞仪检测、比较结肠回流血液中 CCR7^+淋巴细胞的比例。结果模型组、干预组、对照组大鼠在结肠黏膜炎症评分、组织细胞因子含最上差异有统计学意义;模型组、干预组大鼠结肠黏膜下存在淋巴细胞过度归巢现象;模型组、干预组 SLC mRNA 的表达量(0.85±0.05,0.77±0.14)均明显高于对照组(0.31±0.11,均 P<0.01),而模型级和干预组间差异无统计学意义(P>0.05);模型组、干预组 CCR7 mRNA 的表达量(0.79±0.11,0.39±0.12)均明显高于对照组(0.11±0.03,P<0.01),模型组与干预组间差异亦有统计学意义(P<0.05);模型组、干预组结肠静脉回流血中 CCR7^+淋巴细胞的比例(69%±5%,77%±10%)均明显高于对照组(17%±8%,均 P<0.01),而模型组与干预组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论实验性溃疡性结肠炎大鼠的淋巴细胞异常归巢与结肠黏膜的炎症相关,阻断淋巴细胞异常归巢是减轻结肠黏膜炎症的有效途径之一。

Toll样受体4在慢性乙型肝炎病毒感染者外周血单个核细胞中的表达及意义

目的了解慢性乙型肝炎、肝硬化、重型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)中Toll样受体4(TLR4)的作用。方法采用流式细胞术及反转录-PCR方法分别检测37例慢性乙型肝炎,28例肝硬化,31例慢性重型肝炎患者及27例健康对照者PBMC TLR4蛋白及mRNA的表达;同时检测患者肝功能、凝血酶原活动度(PTA)、血常规及HBV DNA滴度。结果各实验组TLR4蛋白及mRNA的表达均明显高于健康对照组(P<0.05);TLR4蛋白的表达水平与TLR4 mRNA的表达量显著正相关(r=0.897,P<0.01),且与患者的ALT、AST、TBil及中性粒细胞百分比之间呈正相关性(r值分别为0.475、0.558、0.924、0.443),而与Alb、PTA及HBV DNA之间呈负相关(r值分别为-0.927、-0.902、-0.272)。结论慢性HBV感染患者外周血TLR4蛋白及mRNA表达的增高与患者的肝脏损害密切相关。

苯基棕榈酰胺吗啡丙醇对卵巢癌多药耐药调节的实验研究

目的 研究葡糖酰基鞘氨醇合酶抑制剂苯基棕榈酰胺吗啡丙醇 (PPMP)对耐阿霉素卵巢癌细胞亚株SKOV3 AdrR的多药耐药基因mdr1及P 糖蛋白的调节。方法 应用细胞培养技术对SKOV3 AdrR细胞进行PPMP处理 ,采用逆转录 聚合酶链反应技术分析mdr1mRNA的表达 ,流式细胞仪检测细胞内罗丹明的荧光强度。结果 浓度为 5、15 μmol L的PPMP可部分抑制SKOV3 AdrR细胞mdr1mRNA的表达 ,2 5 μmol L的PPMP可完全抑制SKOV3 AdrR细胞mdr1mRNA的表达 ,调节作用呈浓度依赖性。PPMP可增加SKOV3 AdrR细胞内罗丹明的荧光强度 ,随着PPMP浓度 (分别为 5、15、2 5μmol L)的增加 ,细胞内罗丹明的荧光强度逐渐增高 (分别为 3 0 1 2 2、3 89 98、4 2 6 0 8)。 结论 PPMP可逆转SKOV3 AdrR的多药耐药性。

CD4^+CD25^+FoxP3^+调节性T细胞与结核病的关系

目的探讨结核病患者中CD4^+CD25^+FoxP3^+调节性T细胞存在状态、功能相关蛋白FoxP3表达水平及其与发病的关系。方法纳入对象包括45例活动性结核患者(包括25例肺结核和20例结核性淋巴结炎)、20例健康对照、20例康复的结核及6例颈淋巴结反应性增生患者。流式细胞术检测外周血中CD4^+CD25^+FoxP3^+调节性T细胞及其FoxP3蛋白的表达强度;荧光定量RT-PCR检测FoxP3 mRNA表达;免疫组化检测淋巴组织中FoxP3蛋白表达。结果活动性结核患者外周血中天然调节性T细胞的比例为2.91%±0.23%,显著高于健康对照(1.22%±0.18%)和康复的结核患者(1.50%±0.17%,P<0.01),FoxP3阳性细胞在CD4^+CD25^+细胞中的比例高于健康对照,结核患者外周血单个核细胞中FoxP3 mRNA水平显著高于健康对照(P<0.05)。免疫组化显示,结核性淋巴结炎组织中FoxP3的表达显著高于反应性增生的淋巴结组织(P<0.01)。结论结核患者调节性T细胞显著增高,提示天然诃节性T细胞可能参与结核病的发生。

反义hTERT体外诱导肺癌细胞凋亡的研究

目的研究反义hTERT基因体外诱导肺癌细胞凋亡。方法体外通过SuperFect(QIAGEN)转染正、反义hTERT真核表达载体至人肺腺癌细胞株GLC82,再经过G418及PCR筛选鉴定获得分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞GLC82s和GLC82as。然后采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析了反义hTERT对肺癌细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡;同时还运用实时荧光定量RTPCR技术及TRAP银染法对各组细胞内源性hTERTmRNA的表达情况及端粒酶的活性进行了检测。结果当各组细胞传至第25代后,与GLC82、GLC82s比较,GLC82as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加;与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低GLC82细胞内源性hTERTmRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。结论反义hTERT体外确实能明显地诱导肺癌细胞的凋亡及抑制瘤细胞的生长增殖能力。

一种新型抗HIV-1药物筛选方法的建立

目的用细胞共培养和流式细胞仪检测建立新型抗HIV－1药物筛选方法，并判断这种方法在筛选抗HIV－1药物中的应用前景。方法把JLTRG细胞和H9／HTLV－ⅢB细胞按照不同比例共培养24，48，72和96h。在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光强度和密度，同时用流式细胞仪测定绿色荧光的表达，并确定培养体系中最佳细胞比例和培养时间。通过选出的最佳条件结合药物半衰期检测恩夫韦肽（T20）和依非韦伦（EFV）的有效性及药物半数抑制量（IC50）。采用HIV－1P24抗原荧光定量PCR法检测病毒载量，并采用Spearman秩相关性分析法判断其与药物浓度及平均荧光强度之间的相关性。结果实验结果显示，JLTRG细胞与H9／HTLV—ⅢB细胞按照10：1的细胞数量比例共培养72h为最佳培养比例和时间。以T20和EFV对共培养体系进行验证，结果显示随着T20和EFV浓度的改变，共培养体系中JLTRG细胞感染HIV－1的程度不同，其IC50分别为10nmol／L和5nmol／L。T20和EFV药物浓度与平均荧光强度以及病毒载量呈负相关（r=－1，－0．986和－1，－l，P〈0．01）；平均荧光强度与病毒载量呈正相关（r=0．986和l，P〈0．01）。结论本研究建立的新型抗HIV一1药物筛选方法具有耗时短、操作方便等优点，可为抗HIV－1药物的筛选提供新的选择。

Cajal间质细胞胃动素受体的表达

目的研究Cajal间质细胞（ICC）上是否有胃动素受体表达。方法以10日龄仔兔小肠为组织来源，采用Ⅱ型胶原酶酶解法并结合密度离心法分离、培养细胞；对培养的ICC细胞，采用免疫细胞化学的方法；应用ICC特异的c．kit抗体进行免疫荧光染色后，用荧光显微镜对其进行鉴定；应用特异性胃动素受体抗体（anti—GPR38）、c—kit蛋白抗体以及细胞核染料（hoechst33342）联合对培养的细胞进行免疫荧光染色；以流式细胞仪分选的ICC为靶细胞，分别采用反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）技术，将提取的细胞总RNA，经反转录后扩增，行3％琼脂糖凝胶电泳；提取的细胞总蛋白，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE），转膜，抗体杂交，发光检{贝4；从基因和蛋白水平来验证ICC是否表达胃动素受体。结果特异性的c—kit蛋白抗体荧光染色鉴定成功培养出兔肠道ICC；细胞免疫荧光三标实验显示ICC胞膜上存在胃动素受体表达；流式细胞仪分析培养的细胞中c—kit阳性细胞比率为64．3％，流式细胞仪分选出阳性细胞分别为6．7×10^5和5．6×10^6；对分选出的ICC提取的总RNA和总蛋白分析检测显示胃动素受体mRNA以及受体蛋白定性分析结果均为阳性。结论兔肠道ICC上有胃动素受体的表达，ICC在胃动素促进肠道运动中起到了重要的作用。