ELISA和Realtime-PCR筛检献血员HBV感染结果分析

目的比较ELISA与Realtime-PCR检测献血员HBV感染的差异,探索准确高效的献血员筛选方法,为提高临床血源质量服务。方法采集502例献血员血样,分离血清,分别采用ELISA与Realtime-PCR方法进行HBsAg和HBV DNA双盲检测,对两法检测结果不一致的献血员2个月后随访并抽血复检。结果502例献血员中,两法初检HBV感染的一致率为97.61%(490/502)(S=5.333 3,P=0.020 9)。2个月后对检测结果不一致的12例献血员复检,有7例2种方法检查均阳性。结论2种方法的初检结果有较好的一致性,均可用于HBV感染检测。Realtime-PCR的检测效果优于ELISA。

武汉献血人群抗-HCV ELISA检测反应性标本联合Realtime-PCR的研究

目的:对现有的2种国产抗-HCV ELISA试剂检出的反应性标本进行Realtime-PCR扩增,对结果进行分析,比较2种方法的检出率。为制定ELISA检测结果假阳性的献血者献血资格的恢复措施提供依据。方法:对日常工作中的检测标本用2种抗-HCV ELISA两步法试剂做初检,反应性结果再次双孔复试。对任何一种试剂经复试检测后仍为反应性的标本进行Realtime-PCR扩增,对所有检测结果进行分析。结果:共检测无偿献血标本63 169份,其中检出抗-HCV反应性标本206份,对206份标本进行Realtime-PCR扩增,共扩增出91例HCV-RNA阳性标本,53例科华试剂单反应性标本中仅2例HCV-RNA结果为阳性,41例新创试剂单反应性标本中6例HCV-RNA结果为阳性。ELISA试剂检出的标本S/CO值在不同的区间内的,都有HCV-RNA为阳性的标本。结论:ELISA试剂检测出的抗-HCV标本很多可能为假阳性,特别是单侧试剂呈反应性的标本。但即使ELISA检测S/CO值仅在灰区的单试剂反应性标本,仍不能排除为HCV感染者。

酸枣仁汤对慢性睡眠剥夺老年失眠大鼠下丘脑GABA及其受体表达的影响

目的：研究酸枣仁汤对慢性睡眠剥夺老年失眠大鼠下丘脑GABA及其受体表达的影响。方法：利用＂多平台水环境法＂建立老年大鼠慢性睡眠剥夺模型,将实验大鼠随机分为4组,环境对照组,慢性睡眠剥夺模型组,舒乐安定组以及酸枣仁汤组。应用免疫组织化学方法观察睡眠剥夺21 d后各组大鼠下丘脑GABA含量的变化,Realtime-PCR法检测大鼠下丘脑GABAARα1和γ2亚单位mRNA表达水平。结果：免疫组化法检测结果表明,与环境对照组比较,慢性睡眠剥夺模型组较环境对照组GABA含量降低（P〈0.05）;与慢性睡眠剥夺模型组比较,舒乐安定组和酸枣仁汤组GABA相对表达量相对升高（P〈0.05）。Realtime-PCR法检测结果表明,与环境对照组比较,慢性睡眠剥夺模型组GABAARα1、GABAARγ2表达下调（P〈0.05）;与慢性睡眠剥夺模型组比较,酸枣仁汤组和舒乐安定组GABAARα1、GABAARγ2表达明显上调（P〈0.05）。结论：酸枣仁汤改善睡眠机制与调控大鼠下丘脑GABA的含量及其受体表达有关。

酸枣仁汤对慢性睡眠剥夺老年失眠大鼠下丘脑5-HT及其受体表达的影响

目的研究酸枣仁汤对慢性睡眠剥夺老年失眠大鼠下丘脑5-HT及其受体表达的影响。方法利用"多平台水环境法"建立老年大鼠慢性睡眠剥夺模型,将实验大鼠随机分为4组,即环境对照组,慢性睡眠剥夺模型组,舒乐安定组以及酸枣仁汤组。应用荧光分光光度法检测5-HT含量的变化,Realtime-PCR法检测大鼠下丘脑5-HT_(1A)R、5-HT2ARmRNA表达水平。结果荧光分光光度法检测结果表明,与环境对照组比较,慢性睡眠剥夺模型组5-HT含量明显降低(P<0.05);与慢性睡眠剥夺模型组比较,舒乐安定组和酸枣仁汤组5-HT含量明显升高(P<0.05)。Realtime-PCR法检测结果表明,与环境对照组比较,慢性睡眠剥夺模型组下丘脑5-HT_(1A)RmRNA表达下调,5-HT_(2A)RmRNA表达上调;与慢性睡眠剥夺模型组比较,舒乐安定组和酸枣仁汤组下丘脑5-HT_(1A)RmRNA表达上调,5-HT_(2A)RmRNA表达下调。结论酸枣仁汤改善睡眠机制与调控大鼠下丘脑5-HT的含量及其受体表达有关。

高效快速检测食物中猪成分的PCR和RT-PCR方法

依据猪线粒体DNA中的细胞色素b基因序列设计一对特异性引物,用于检测食物中的猪源成分DNA扩增片段(130bp)可以从猪的基因组中检出而对其它物种(牛、羊、鸡等)样品的检测为阴性,且在各种组织中稳定存在,亦可应用于实时荧光PCR从加工的熟食和混合食物中灵敏地检出痕量猪DNA。

民猪和大白猪背最长肌中肌红蛋白基因的表达量差异

为揭示肌红蛋白基因对民猪和大白猪肉色的影响,本实验选取体重95 kg民猪、160日龄民猪和大白猪(体重95 kg,160 d)各6头,共计18头,取胸腰椎连接部背最长肌鲜肉样进行肉色检测,采用Realtime-PCR法检测民猪和大白猪背最长肌中肌红蛋白基因的表达差异。结果表明:同体重和同日龄的民猪肉色红度值均高于大白猪(P<0.05),民猪肌红蛋白mRNA表达量均高于同体重和同日龄的大白猪(P<0.05),在一定程度上说明民猪与大白猪肉色差异的主要因素是肌红蛋白含量。

Wnt家族成员在TA2小鼠乳腺癌生成过程中基因表达变化规律

目的:研究乳腺癌生成过程中,Wnt家族成员表达的变化规律。方法:收集自发乳腺癌小鼠42只,记录其详细资料。采用基因芯片筛选正常TA2小鼠乳腺组织和自发乳腺癌TA2小鼠乳腺癌组织中的差异表达基因,随后用Real-time PCR进行验证,并检测TA2小鼠乳腺癌形成过程中相关基因表达的变化。结果:TA2自发乳腺癌小鼠平均见瘤年龄为(336.706±85.05)d,平均分娩次数为(3.767±1.79)次。分娩次数最多者为7次,其平均见瘤年龄只有251.5 d。TA2小鼠基因芯片结果发现Wnt家族成员中,Wnt1、Wnt10b、Wnt5a、Wnt5b在正常乳腺组织和乳腺癌组织中表达具有差异。Real time PCR的结果证实了以上结果,并发现Wnt1、Wnt10b、Wnt5a在癌前病变和乳腺癌组织中表达高于正常乳腺组织,而Wnt5b在乳腺癌组织中表达低于正常乳腺组织。结论:Wnt1、Wnt5a、Wmt10b在TA2小鼠乳腺癌生成过程中起促进作用,而Wnt5b的作用可能是抑制小鼠乳腺癌的生成。

BrdU标记大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨能力的变化

背景:BrdU标记是一种标记率高、标记简便的标记物,但其毒性报道不一。目的:观察BrdU标记对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖与成骨能力的影响。方法:直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,0.2%Brdu标记后检测其增殖能力、克隆形成能力;经成骨诱导液诱导培养3周后,利用茜素红染色,荧光免疫组织化学和RT-PCR观测标记前后骨髓间充质干细胞成骨能力的变化情况。结果与结论:Brdu标记后骨髓间充质干细胞克隆形成能力明显减弱,在克隆个数和面积上均小于正常对照组(P<0.05);在增殖能力方面,BrdU标记后第4天开始进入对数增长期时增殖较慢,高峰较低(P<0.05);在成骨能力方面,经成骨诱导后BrdU标记组与正常对照组的骨髓间充质干细胞均表达骨钙素、Ⅰ型胶原,并且都有明显的钙结节形成,RT-PCR检测显示标记前后骨髓间充质干细胞在骨钙素基因的表达方面差异无显著性意义(P>0.05)。提示BrdU标记抑制骨髓间充质干细胞的克隆增殖形成能力,但不会降低其成骨分化能力,可以广泛应用于骨髓间充质干细胞作为种子细胞干细胞研究的示踪剂。

结肠癌中RHAMM与ERK2的表达及其与临床病理特征的关系

目的:探讨透明质酸介导运动的受体(receptor for hyaluronan-mediated motility,RHAMM)和ERK2(extracellular signal-regulated kinase)在结肠癌组织中表达及其与临床病理因素的关系,评估其在结肠癌诊断及预后中的价值。方法:收集我院结肠癌患者标本30例及其相应癌旁组织,通过real-timePCR对RHAMM和ERK2进行检测。结果:RHAMM和ERK2在结肠癌组织较癌旁组织表达均明显升高(P<0.001),且两者表达在低分化、中分化和高分化3组组间差异无显著性(P=0.222和P=0.173),但都与是否发生淋巴结转移有关(P=0.01和P<0.001);两者表达具有一定相关性(P=0.009,r=0.465)。结论:结肠癌中的RHAMM和ERK2表达都高于正常组织,且两者表达有相关性,RHAMM可能通过Ras-ERK途径参与了结肠癌的发生、进展及转移,RHAMM和ERK2可作为患者诊断和预后的参考指标之一。

具有中和活性的抗人IL-1β单链抗体的构建

目的构建抗人IL-1β单链抗体(anti-hIL-1βscFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行生物学活性检测。方法使用PCR的方法从含有抗人IL-1β抗体基因的质粒中获得抗人IL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b中,构建重组表达载体pET-27b-hIL-1βscFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后诱导表达,经凝胶过滤色谱柱上复性得到可溶的抗人IL-1β的scFv蛋白。使用ELISA方法鉴定scFv抗体的特异性结合活性,使用Real time-PCR的方法检测scFv抗体的中和活性。结果成功地对抗人IL-1β单链抗体进行诱导、表达和复性,蛋白相对分子质量约为28 000。ELISA结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。Real time-PCR实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断人IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-18及IL-1β的作用。结论通过原核表达系统得到的抗人IL-1β单链抗体经复性后,与人IL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和活性,为进一步研究人IL-1β相关疾病及其治疗性抗体奠定了基础。

浓香型和淡香型百合单萜合酶基因差异表达

【目的】东方百合香味浓,亚洲百合香味淡,花香差异明显。选取白色的东方百合‘西伯利亚’(Lilium‘Siberia’)和亚洲百合‘罗马广场’(Lilium‘NOVANO’)为材料,拟通过分析单萜合成酶基因差异表达,揭示花香差异原因。【方法】采用RT-PCR方法克隆百合单萜合酶基因,并通过Realtime-PCR分析两种百合不同花期的单萜合酶基因表达。【结果】从Lilium‘Siberia’和Lilium‘NOVANO’花瓣中克隆得到芳樟醇合酶基因Li-Li S和月桂烯合酶基因Li-My S.Li-Li S的核苷酸序列与油棕的序列与油棕、海枣相似度分别达到66%、67%,蛋白的氨基酸序列与油棕、可可相似度分别为48%、44%。Li-My S的核苷酸序列与六出花、烟草相似度分别达到为69%、42%,蛋白的氨基酸序列与六出花、葡萄同源性分别为51%、49%。在花蕾、半开、盛开、衰败四个花期中,Lilium‘Siberia’花瓣两个单萜合成酶基因表达水平均高于Lilium‘NOVANO’,并且除了Li-My S在盛开期和衰败期外,均表现出显著差异。【结论】单萜合成酶基因的差异表达是导致东方百合和亚洲百合香味差异的一个重要原因。

inlA和inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌侵袭HT29结肠癌细胞的影响

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的食源性致病菌,其可以穿透多个宿主屏障,而内化素蛋白家族被认为是LM穿透宿主屏障过程中起重要作用的毒力因子。本研究利用同源重组的方法构建了LM野生菌株EGDe的inl A和inl B基因双缺失菌株,利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测其主要毒力基因表达的变化,并以HT29结肠癌细胞为对象,研究inl A和inl B基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响。结果表明基因的缺失对其生长能力没有影响,但多个毒力基因的表达发生了不同程度的变化,同时发现inl A和inl B基因的缺失使LM侵袭HT29结肠癌细胞的能力显著下降(P<0.05)。本研究成功构建LM的inl A和inl B基因双缺失菌株,并初步研究了基因缺失对LM侵袭宿主细胞能力的影响,为深入研究内化素Inl A和Inl B在LM入侵宿主细胞过程中的具体作用提供了支持。

单核细胞增生性李斯特菌inlA和inlB基因缺失菌株的构建

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的食源性致病菌,其对恶劣环境有较强的抵抗力,广泛存在于各种食品加工环境,容易引起严重的食品安全问题。LM是一种胞内寄生菌,其毒力因子内化素A(internalin A,InlA)和内化素B(internalin B,InlB)被认为在LM穿透宿主屏障、入侵宿主细胞以及胞间传播等过程中起到重要作用。本文利用同源重组法将LM野生菌株EGDe的inlA和inlB基因的敲除,对inlA和inlB基因缺失菌株的基本生物学特性进行研究,并运用RealTime-PCR监测LM的毒力基因表达。实验结果表明,基因的缺失对突变菌株的生长以及对环境中的氯化钠(NaCl)和乙醇(EtOH)的耐受能力没有影响,但多个毒力基因的表达量明显下降。该缺失菌株的构建为进一步研究InlA和InlB在LM入侵宿主细胞过程中的具体功能提供了重要材料。

ATF3基因在正常小鼠脑组织中的表达定位研究

ATF3(activating transcription factor 3)作为压力诱导因子,在接受外界信号后能够迅速升高表达,调节靶基因,维持细胞稳态,因而被认为和多种疾病相关,关于ATF3在正常组织的功能目前并不清楚.为了确认ATF3在正常小鼠脑中是否表达,利用RT-PCR、Realtime-PCR、Western blot和免疫组化方法检测了ATF3的表达.实验结果显示:ATF3 m RNA和蛋白在所有正常小鼠的额叶、顶叶、枕叶、颞叶、丘脑、小脑和海马等部位均有表达,且不同部位的ATF3 m RNA和蛋白表达量没有统计学差异.证明了ATF3在小鼠脑正常生理状态下能够稳定表达,提示该基因在正常小鼠脑中具有生理功能.

宫颈癌组织ICAM-1和VEGF表达与放疗敏感相关性研究

目的:研究细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管内皮生长因子(vascular endothalial growth factor,VEGF)在宫颈鳞癌组织中的表达及其与放疗敏感性的相关性。方法:选取2007-07-01-2008-06-30在南通市肿瘤医院妇瘤科住院行根治性放疗的60例宫颈鳞癌患者。采用Realtime-PCR技术检测ICAM-1mRNA和VEGF mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达,分析不同放疗敏感性患者ICAM-1mRNA和VEGF mRNA表达水平差异,探讨ICAM-1mRNA和VEGF mRNA之间的相关性。结果:宫颈鳞癌组织放疗前后ICAM-1mRNA表达水平分别为124.57±58.64和47.38±39.27,差异有统计学意义,P=0.008;VEGF mRNA的表达水平分别为152.75±66.92和73.46±54.41,差异有统计学意义,P=0.023;ICAM-1mRNA和VEGF mRNA的表达在放疗抵抗组和放疗敏感组中差异均有统计学意义,P值分别为0.027和0.009;近期疗效中,肿瘤消失组中ICAM-1mRNA和VEGF mRNA表达存在一定相关性,r=0.468,P=0.016;肿瘤未控组中ICAM-1mRNA和VEGF mRNA表达存在一定相关性,r=0.693,P=0.031。远期疗效中,肿瘤治愈组中ICAM-1mRNA和VEGF mRNA表达亦存在一定相关性,r=0.457,P=0.023;肿瘤复发组中ICAM-1mRNA和VEGF mRNA表达亦存在一定相关性,r=0.637,P=0.018。结论:ICAM-1高表达与宫颈鳞癌放疗抵抗性有关,并且与VEGF的表达在放射抵抗中具有一定的相关性。

2010年云浮市手足口病病原学监测结果分析

目的对2010年云浮市哨点医院手足口病(HFMD)监测结果进行分析,了解云浮市手足口病的病原学特征,为云浮市手足口病的防治提供科学的依据。方法收集73例监测哨点医院手足口病病例送检的粪便标本,应用Real time—PCR技术检测肠道病毒7l型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CAl6)、非EV7l和CAl6的其它肠道病毒核酸。结果 73例手足口病患者中42例为肠道病毒核酸阳性,阳性率为57.5%,其中EV71病毒、CAl6病毒以及非EV7l和CAl6的其它肠道病毒分别占总阳性数的71.4%、7.1%、21.4%。三种不同型别肠道病毒在全年中交替变更;病毒检出高峰出现在5～6月,病例人群男性高于女性(1.92:1),4岁以下儿童病例阳性率最高。结论云浮市2010年手足口病疫情发病高峰为5-6月,4岁以下儿童病例发病数最多,肠道病毒EV71型是2010年云浮市手足口病流行的主要毒株类型。开展手足口病流行病学和病原学研究,将有助于提出更好的预防和控制措施。

播娘蒿耐寒基因DsKIN1的克隆、序列分析及冷诱导表达分析

播娘蒿是极端耐寒的冷诱导植物,研究其低温胁迫下的冷响应基因对于揭示其抗寒性具有重要意义.根据拟南芥At KIN1和At KIN2同源比对,设计同源引物进行播娘蒿KIN基因克隆,通过RACE技术克隆得到Ds KIN1基因,利用Vector NTI11.5软件对其进行序列分析,采用Realtime-PCR测定Ds CBF1、Ds CBF2、Ds COR和Ds KIN1基因在不同处理方式[整株低温处理、同一植株局部低温处理和局部未受低温处理(两部分植株)]下各时间段(0.2 h、0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h)的表达,采用String数据库预测分析与Ds KIN1相互作用的蛋白.结果显示,Ds KIN1基因序列全长为462 bp,开放阅读框ORF长度为198 bp,编码66个氨基酸,分子量(Mr)为6.61×10~3,理论等电点为9.10,亲水性好.播娘蒿Ds CBF1和Ds CBF2在0.2 h开始表达,在2 h达到最大,随后下降.在冷诱导0.2 h后,Ds CBF调控的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1基因开始表达,均呈现上调的趋势.整株、局部冷诱导植株与同一植株上未受低温胁迫部位的耐寒基因Ds COR和Ds KIN1表达模式类似.此外发现与Ds KIN1相互作用的蛋白大部分为低温诱导蛋白、盐和渗透压胁迫响应的信号蛋白、与渗透调节有关的家族蛋白、RING-H2锌指蛋白2B以及未知蛋白等.本研究说明播娘蒿局部冷诱导时,冷信号可进行传递,使未受冷诱导部位获得耐寒性能.