多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗构建及其表达效率

目的 构建多房棘球绦虫（Em）重组卡介苗（BCG—EmⅡ／3）疫苗，分析EmⅡ／3分子在该疫苗中的表达效率。方法 超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA，通过RT-PCR扩增EmⅡ／3的抗原编码基因；将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG，构建重组质粒pBCG—EmⅡ／3；电穿孔法转化BCG，构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗。免疫印迹分析重组BCG-EmⅡ／3疫苗的表达产物。结果 RT-PCR成功扩增出1680bp的EmⅡ／3抗原编码基因；双酶切证实EmⅡ／3抗原编码基因成功插入pBCG中；PCR证实rBCG—EmⅡ／3疫苗构建成功；免疫印迹分析发现重组BCG—EmⅡ／3疫苗的表达产物在相对分子质量（Mr）约为65×10^3处有明显的目的蛋白表达条带，且能被活动性泡球蚴病鼠血清特异识别。结论 成功构建了多房棘球绦虫重组BCG—EmⅡ／3疫苗，为疫苗的开发和利用打下了坚实的理论基础。

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠的免疫保护力观察

目的探讨多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫鼠后对Em原头节攻击感染的保护性作用。方法将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/c小鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率,测定血清中IgG及其亚类和IgE水平;分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有空载体、BCG和PBS对照。结果疫苗接种组的减蚴率为45·29%～76.47%,血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgE水平明显升高,IgG1和IgG3显著降低;疫苗接种组的脾CD4+T细胞亚群显著增加,CD8+T细胞亚群无明显变化,CD4+/CD8+亚群比值明显升高。结论多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗鼻腔内接种是一种较好的途径,IgG、IgG2a、IgG2b和IgE以及CD4+T细胞亚群在疫苗诱导的保护力中起重要作用。

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗诱导的保护力观察

目的探讨多房棘球绦虫（Em）重组卡介苗（BCG-EmⅡ／3）疫苗免疫对Em原头节攻击感染的保护性作用。方法Balb／c小鼠随机分为疫苗皮下注射组、鼻腔接种组、空载体对照组、卡介苗（BCG）对照组和磷酸缓冲液（PBS）对照组。接种免疫8周，用Em原头节进行攻击感染，感染后18周剖杀小鼠，称取检获泡球蚴质量，计算减蚴率，并用ELISA法测定血清中IgG及其亚类和IgE水平。结果与PBS对照组比较，疫苗皮下注射组和鼻腔内接种组小鼠检获泡球蚴质量均降低（q=2．65、3．68，P〈0．05或〈0．01），疫苗鼻腔内接种组与皮下注射组比较，检获泡球蚴质量降低（q=2．78，P〈0．05），疫苗接种组的减蚴率为63．23％～74．70％；与疫苗鼻腔内接种前比较．接种后和Em原头节攻击后小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b和IgE水平均明显升高（P〈0．05或〈o．01），IsG1降低（P〈0．01），IgG3未见明显改变（P〉0．05）。结论重组BCG-EmⅡ／3疫苗鼻腔内接种是一种较好的途径．IgG、IgG2a、IgG2b和IgE在疫苗诱导的保护力中起重要作用。

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗诱导小鼠脾细胞凋亡的研究

目的探讨多房棘球绦虫(Em)重组卡介苗(BCG-EmⅡ/3)疫苗免疫对Em原头节攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法Balb/c小鼠随机分为疫苗皮下注射组、鼻腔接种组、空载体对照组、卡介苗(BCG)对照组和PBS对照组。免疫8周时用Em原头节攻击感染,感染后18周剖杀小鼠,计算减蚴率;取脾分离脾细胞,流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率。结果与PBS对照组相比,疫苗皮下注射组和鼻腔内接种组小鼠检获泡球蚴质量均降低(q=2.65、3.68,P<0.05或P<0.01),疫苗鼻腔内接种组与皮下注射组比较,检获泡球蚴质量明显降低(q=2.78,P<0.05),疫苗接种组的减蚴率为63.23%～74.70%;疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于PBS对照组(P<0.01);皮下注射组的脾细胞凋亡发生率明显低于鼻腔内接种组(P<0.01)。结论泡球蚴感染可引起小鼠脾细胞发生凋亡。多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3疫苗接种可抑制感染鼠脾细胞凋亡。

多房棘球绦虫重组质粒BCG-Em Ⅱ/3-10的构建及意义

目的:构建多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10,探索泡球蚴病防治的新途径。方法:超声粉碎泡球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增EmⅡ/3-10抗原编码基因,将该基因定向克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG,构建重组质粒pBCG-EmⅡ/3-10,电穿孔法将该质粒导入BCG构建多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ/3-10。结果:经过PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因的大小和插入方向正确。结论:成功构建了多房棘球绦虫重组质粒BCG-EmⅡ/3-10,为进一步研究多房棘球绦虫重组疫苗奠定基础。

多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗诱导小鼠脾脏T细胞亚群的变化

目的:探讨多房棘球绦虫混合重组BCG-EmⅡ/3和BCG-Em14-3-3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化。方法:将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫BALB/C鼠,免疫后8周用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染,感染后18周杀鼠取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比,同时设有空载体、BCG和PBS对照。结果:疫苗接种组的脾CD4+T细胞亚群显著增加,CD8+T细胞亚群无明显变化,CD4+/CD8+亚群比值明显升高;皮下注射组的CD4+和CD4+/CD8+亚群比值显著高于鼻腔内接种组。结论:CD4+T细胞亚群在多房棘球绦虫重组BCG-Em14-3-3疫苗诱导的小鼠抗Em原头节攻击感染的保护性免疫机制中起一定作用。

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对小鼠脾细胞凋亡的影响

目的检测多房棘球绦虫重组双歧杆菌（Bb）-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗对原头蚴攻击小鼠脾细胞凋亡的影响。方法用重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗分别通过皮下注射、肌肉注射、鼻腔粘膜接种以及口服接种免疫BALB/c小鼠12周后,用50个多房棘球绦虫原头蚴腹腔注射进行攻击,攻击感染后18周剖杀小鼠,检获泡球蚴组织,称取重量,计算减蚴率;分离脾细胞,用ConA刺激培养16-18h,然后用流式细胞仪检测脾细胞凋亡。结果疫苗免疫组小鼠检获泡球蚴质量均明显低于PBS对照组;小鼠脾细胞原液组和ConA刺激组细胞凋亡发生率均显著低于PBS对照组（P〈0.05或P〈0.01）,每个ConA刺激组脾细胞凋亡发生率显著高于相应的原液组（P〈0.05或P〈0.01）,皮下注射组脾细胞凋亡发生率最低。结论多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗可抑制感染小鼠脾细胞发生凋亡,增加CD4＋T细胞亚群的数量,诱导宿主产生一定的保护力,对抗Em原头节攻击。

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3疫苗的构建及其表达效率

目的:构建多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)重组双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb)-EmⅡ/3疫苗,并研究EmⅡ/3分子在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达效率。方法:通过PCR扩增EmⅡ/3抗原编码基因;将该基因定向克隆于含有谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione s-transferase,GST)基因的大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-EmⅡ/3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3疫苗。经PCR和酶切鉴定后以IPTG诱导表达EmⅡ/3/GST融合蛋白;SDS-PAGE及Westernblot对表达产物进行鉴定。结果:PCR成功扩增出1759bp的EmⅡ/3基因;双酶切证实EmⅡ/3基因插入pGEX-1λT中;PCR和双酶切证实重组Bb-EmⅡ/3疫苗构建成功;SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒转化宿主菌在IPTG诱导下高效表达了EmⅡ/3/GST融合蛋白。结论:成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3疫苗,重组质粒pGEX-EmⅡ/3在大肠杆菌中获得了高效表达,Westernblot结果提示表达出的EmⅡ/3重组蛋白具有特异的抗原活性。

多房棘球绦虫重组BCG-EmⅡ／3疫苗诱导小鼠脾细胞因子变化的研究

目的探讨多房棘球绦虫（Em）重组BCG-EmⅡ／3疫苗免疫和Em原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化。方法将Balb／c小鼠按体质量随机分为3组：疫苗皮下注射组、疫苗鼻腔内接种组、对照组。免疫后8周用Em原头节进行攻击感染，感染后18周杀鼠取脾，分离脾细胞，分别用原液、Em抗原（EmAg）、刀豆蛋白A（ConA）或植物血凝素（PHA）培养，酶联免疫吸附（ELISA）法检测脾细胞培养上清液中白细胞介素2（IL-2）、1干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素4（IL-4）水平。结果疫苗皮下注射组原液培养条件下IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4水平分别为（34．6±2．7）、（34．5±2．8）、（265．0±0．0）、（9．8±2．6）ng／L，与对照组[（25．0±1．9）、（30．0±0．0）、（10．0±0．0）、（12．5±2．7）ng／L]比较差异均有统计学意义（P〈0．01或〈0．05）；疫苗鼻腔内接种组原液培养条件下上述4种指标分别为（32．5±2．2）、（33．6±2．7）、（130．0±0．0）、（10．4±2．7）ng／L，与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01或〈0．05）；疫苗皮下注射组原液培养条件下TNF-α水平明显高于疫苗鼻腔内接种组（P〈0．01）。EmAg、ConA（或PHA）刺激培养条件下，上述4种指标明显高于相同组别的原液培养（P〈0．01），且ConA（或PHA）刺激培养条件下，上述4种指标明显高于相同组别的EmAg刺激培养条件（P〈0．01）。结论多房棘球绦虫重组BCG－EmⅡ／3疫苗诱导小鼠产生辅助T淋巴细胞（Th）1型免疫反应，从而对抗Em原头节攻击感染。