重组水蛭素Ⅲ的抗凝与抗血栓作用研究

目的 研究了自行研制的重组水蛭素Ⅲ在大肠杆菌中的分泌表达产物的抗凝与抗血栓作用。方法 采用大鼠下腔静脉血栓模型和大鼠体外A V循环模型进行水蛭素Ⅲ (HV3)的抗凝及抗血栓作用研究。结果 给予重组水蛭素 2 5 ,5 0 μg/kg两剂量的大鼠下腔静脉血栓重量分别为 2 1.30± 7.35mg和 10 .4 0± 16 .2 0mg ,生理盐水对照组为 5 9.5 0± 4 .95mg ;重组水蛭素 5 0、2 5 μg/kg的血栓湿重为 15 .3± 3.6mg和 2 1.5± 5 .3mg ,生理盐水对照组为 4 8.6± 4 .9mg。结论 重组水蛭素Ⅲ可显著减少静脉血栓重量 ,能显著地降低体外循环的血栓湿重 ,与生理盐水组比较具有很显著的差异 ,结合体外抗凝实验等结果表明 ,重组水蛭素Ⅲ具有很强的体外和体内抗凝抗栓作用 。

重组水蛭素Ⅲ口服制剂给药系统的初步研究

目的探讨重组水蛭素Ⅲ(以下简称rHV3)的口服制剂。方法采用在体原位肠袢法研究小肠和结肠在吸收促进剂作用下对rHV3的吸收情况,寻找促进rHV3肠道吸收的吸收促进剂和吸收位置;合成蛋白酶抑制剂——壳聚糖-EDTA轭合物(chitosan-EDTAconjugates,CEC),考察rHV3在胃蛋白酶和胰蛋白酶中的稳定性;将rHV3和促吸收剂、CEC乳化,考察其抗凝血作用。结果吸收促进剂能提高rHV3在肠道内的吸收水平,其中在0.5%EDTA-Na2的作用下rHV3经由小肠给药产生的抗凝血作用最强;CEC在消化酶的存在下对rHV3有保护作用;乳化微粒与单用rHV3的抗凝血作用有显著性差异。结论重组水蛭素Ⅲ和促吸收剂以及CEC形成的乳化微粒经灌胃能够发挥其抗凝血作用。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞凋亡相关基因表达的影响

背景重组水蛭素Ⅲ（rHV3）对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞（LECs）有较好的保护作用，但其分子机制尚不清楚。目的探讨rHV3对半乳糖损伤的人LECs凋亡相关基因表达的影响。方法用本课题组构建的表达重组水蛭素工程菌，参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行水蛭素生物学活性的测定。将培养的人LECs分为3组，培养于含质量分数10％胎牛血清（FBS）的D／F12培养液作为正常组、用含125×10^-3mol／LD一半乳糖的D／F12培养液建立人LECs株SRAOI／04损伤模型为模型组，用2000U／ml（商品单位）rHV3加入部分损伤模型培养液中进行干预作为rHV3组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测各组人LECs内凋亡相关基因的表达，包括醛糖还原酶（AR）、bcl2、bax、p53基因mRNA的表达水平，各目的基因表达丰度用目的基因的吸光度（A）值与3一磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）A值的比值表达。结果与正常组比较，模型组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显高于对照组，差异均有统计学意义（t=3．90E一06、t=8．44E一04、t=5．15E一08，P〈0．叭），而水蛭素干预组人LECs中ARmRNA／GAPDHmRNA、baxmRNA／GAPDHmRNA和p53mRNA／GAPDHmRNA值明显低于模型组，差异均有统计学意义（t=5．90E一06、t=1．51E．04、t=3．42E一06，P〈0．01）。与正常组比较，模型组人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值明显降低，差异有统计学意义（t=1．86E一05，P〈O．01），与模型组相比，水蛭素干预后人LECs中的bcl2mRNA／GAPDHmRNA值显著提高，差异有统计学意义（t=8．56E一05，P〈0．01）。结论D一半乳糖导致人LECs损伤，rHV3可能通过抑制多元醇途径和线粒体介导的凋亡途径对人LECs起保护作用。

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用

为研究重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用,采用D-半乳糖建立人晶状体上皮细胞损伤模型,用重组水蛭素Ⅲ作用于受损细胞,设置正常组、模型组、低、中和高剂量重组水蛭素Ⅲ组以及阳性药白内停组,观察各组细胞密度和形态,用MTT法检测各组细胞存活率,考察各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果表明,当D-半乳糖浓度为50×10-3mol/L时,模型组与正常组细胞有显著差异。重组水蛭素Ⅲ作用后受损细胞的存活率和SOD活性显著提高。因此,重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞有明显的保护作用。

冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性研究

目的研究冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性,为选择包装材料、确定贮藏条件和有效期提供依据。方法通过影响因素实验,加速实验和长期稳定性实验,对其外观性状、溶解性、干燥失重、活性等进行研究。结果该制剂的主要影响因素是湿度和温度,光照影响不大;加速试验条件下6个月时活力能保持80%左右,其他指标正常;长期稳定性试验条件下,放置12个月后,各项指标均符合质量标准。结论该制剂可在室温下稳定保存12个月。

基于3A组装的多拷贝基因策略优化重组水蛭素变体Ⅲ的生产

水蛭素变体Ⅲ(Hirudin varidantⅢ,Hv3)是一种从水蛭中提取的活性成分,在预防和治疗白内障方面具有潜在作用。为了制备足量Hv3用于进一步的临床前应用研究,该研究开发了一种在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中高效、稳定表达重组水蛭素变体Ⅲ(recombinant Hirudin varidantⅢ,Rhv3)的办法。首先,在C.glutamicum中构建含Ptac启动子和CspA信号肽的Rhv3分泌表达菌株,比较其在不同培养基中的表达情况。结果表明在BHI培养基中Rhv3活性最高,达到3.02×10^(3) ATU/L。为进一步提升Rhv3产量,通过核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)筛选,选用RBS1应用于Rhv3多拷贝菌株构建和表达。然后利用3A组装技术构建含不同信号肽和不同拷贝数的Rhv3分泌表达菌株进一步优化其产量。通过放大发酵培养,Rhv3产量达到1.89 g/L,活性达到10.91×10^(3) ATU/L。最后利用镍柱对Rhv3进行简单纯化,其纯度达到90%。该异源表达策略有效提高Rhv3表达量,为Rhv3的重组生产提供了一种质量可靠、低成本的表达体系。

抗体夹心酶免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3研究

将重组E. coli水蛭素HV3和BSA交联后免疫豚鼠和家兔,DEAE-纤维素柱层析纯化IgG.用这两种抗体和酶标二抗羊抗兔IgG-HRP建立三抗体夹心酶联免疫吸附法,测定重组E. coli水蛭素HV3的含量.本测定方法的线性范围为0～2 ng/ml,灵敏度为0.04 ng/ml.建立的三抗体夹心酶联免疫吸附法测定重组E.coli水蛭素HV3具有良好的精密度、回收率、灵敏度和特异性.

重组水蛭素Ⅲ对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞热应激蛋白表达的影响

探讨重组水蛭素Ⅲ(rHV3)对半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞(hLEC)热应激蛋白(Hsp)表达的影响。采用125×10-3mol/LD-半乳糖建立人晶状体上皮细胞SAR01/04损伤模型,用重组水蛭素Ⅲ干预受损细胞,设置正常组、模型组、和重组水蛭素Ⅲ组,用倒置显微镜观察各组细胞密度和形态,RT-PCR检测人晶状体上皮细胞内3种热应激蛋白mRNA的表达。结果显示,125×10-3mol/LD-半乳糖导致人晶状体上皮细胞显著损伤,3种热应激蛋白,即Hsp70、Hsp27和αB-晶体蛋白的mRNA表达显著上调。重组水蛭素Ⅲ的干预使细胞形态趋于正常,细胞内Hsp70、Hsp27和αB晶体蛋白的mRNA表达显著下调。因此,重组水蛭素Ⅲ能有效缓解高浓度半乳糖导致的热应激蛋白应激耐受,从而保护晶状体上皮细胞。

重组水蛭素Ⅲ乳化微粒口服的药效学

目的探讨重组水蛭素Ⅲ乳化微粒(rHVⅢEP)口服的抗凝血、抗血栓作用。方法①将SD大鼠随机分为4组,分别为水蛭素大、小剂量组(65,130U·g-1),华法林钠阳性对照组和生理盐水组。分别于给药前、后1h各取血1.5～2mL,测定凝血时间(CT)、血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶凝固时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT);②采用大鼠弥散性血管内凝血模型,测定PT、TT、APTT;③动物分组如上,采用大鼠下腔静脉血栓模型,测定血栓湿重和干重,计算血栓抑制率;④动物分组如上,采用大鼠颈动静脉回路形成的血小板性动脉血栓模型,测定血栓湿重,计算血栓抑制率。结果①rHVⅢEP能延长CT、PT、TT、APTT,与空白对照组有显著差异(P<0.05或P<0.01);②rHVⅢEP能延长大鼠弥散性血管内凝血模型PT、TT、APTT,并与生理盐水组有显著差异;③rHVⅢEP口服可使大鼠下腔静脉血栓湿重、干重明显减少,血栓抑制率显著升高,与生理盐水组有显著差异;④rHVⅢEP口服可使大鼠颈动静脉回路形成的血小板性动脉血栓重量明显减少,显著升高血栓形成抑制率,与生理盐水组有显著差异。结论rHVⅢEP口服抗凝血、抗血栓作用显著,可用于防治实验性大鼠弥散性血管内凝血、大鼠颈动静脉回路形成的血小板性动脉血栓和大鼠下腔静脉血栓,具有良好的应用前景。

重组水蛭素Ⅲ口服乳糜微粒的研究

为了实现重组水蛭素Ⅲ口服给药途径并验证其药效,将其制成乳糜微粒,比较了3种制备方法,确定了逆相蒸发法为r HV3乳糜微粒的最佳制备方法。优化了制备条件,通过正交实验确定了r HV3乳糜微粒配方,制得的r HV3乳糜微粒的包封率为(65.08±1.96)%。在-20℃保存条件下r HV3乳糜微粒稳定性良好。药效学实验结果表明,口服r HV3乳糜微粒具有良好的抗凝和抗栓作用。

重组水蛭素Ⅲ滴眼液的组织分布和排泄研究

为了研究重组水蛭素Ⅲ(recombinant hirudin Ⅲ,rHVⅢ)滴眼剂在新西兰兔中的组织分布和粪尿排泄,用氯胺-T法将放射性同位素125I标记到rHVⅢ的酪氨酸残基上,通过同位素示踪方法考察滴眼给药后125I-rHVⅢ在新西兰兔体内的组织分布和粪尿排泄。结果发现新西兰兔滴眼给予125I-rHVⅢ后,125I-rHVⅢ主要通过肾脏排出,给药后120 h通过尿液排出放射性活度占总放射性活度的(81.54±10.78)%,同时通过粪便排出的放射性活度仅为(6.20±2.05)%。将放射性活度高的尿液,经RP-HPLC分离,实验结果表明尿液中存在重组水蛭素Ⅲ原型且比例达23.52%以上。组织分布实验结果表明,rHVⅢ原型及其代谢物在肾脏、血浆分布最多,脑中几乎无分布;rHVⅢ原型及其代谢物在眼部主要分布在角膜及巩膜,房水也有分布,而玻璃体和晶状体几乎没有分布。因此,rHVⅢ主要通过肾脏代谢并以原型和代谢物的形式通过尿液排出体外。

双作用靶点水蛭素Ⅲ突变体库(R_(33)G_(34)D_(35)X_(36-r)HV3)的构建及最适突变体筛选

构建水蛭素Ⅲ(HVⅢ)突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ,从中筛选出具有与重组水蛭素Ⅲ(rHV3)抗凝血酶活性比活力相当,同时又具有很强的抗ADP诱导的血小板聚集抑制率的双作用靶点水蛭素Ⅲ突变体。通过基因定点突变技术构建水蛭素Ⅲ突变库R33G34D35X36-rHVⅢ,表达纯化后通过凝血酶滴定方法测定其抗凝血酶比活性,同时测定其抗ADP诱导的血小板聚集比活性。结果显示所有突变体的抗凝血酶比活性未发生变化,但各突变体抗ADP诱导的血小板聚集的比活性各异,当第36位为Met和Ser时所表现的抗ADP诱导的血小板聚集的比活性最强。由此可知水蛭素Ⅲ(HVⅢ)突变体库R33G34D35X36-rHVⅢ中第36位氨基酸种类对其抗凝血酶活性影响不大,但对其抗ADP诱导的血小板聚集的比活性影响较大,当该位点为Met和Ser时突变体具有很好的抗凝血酶和抗ADP诱导的血小板聚集的双重药理活性。

重组水蛭素Ⅲ多克隆抗体的制备

目的:制备重组水蛭素Ⅲ(rHV3)多克隆抗体。方法:分别用戊二醛法与碳二亚胺法处理抗原,电泳检测rHV3自身交联及与牛血清白蛋白(BSA)交联结果;分别免疫家兔、豚鼠和大鼠后取血清,双向免疫扩散试验测定效价。结果:rHV3交联BSA后作为抗原免疫豚鼠和家兔产生了抗体,抗体效价1∶16。结论:rHV3交联BSA作为rHV3抗原免疫家兔、豚鼠可以产生rHV3多克隆抗体。

重组水蛭素克隆的表达及其产物的分离纯化

目的：在原核细胞中表达具有生物活性的重组水蛭素变异物１（ｒＨＶ１）并进行重组产物的分离纯化研究。方法：以质粒ｐＢＶ２２０为载体，在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ｒＨＶ１，发色底物法测定其抗凝血酶生物活性；利用超滤、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０以及凝血酶亲合层析进行重组产物的分离纯化。结果：在大肠杆菌中获得了ｒＨＶ１的活性表达，表达量约占总蛋白的１６．９％，活力达到２０～３０ＡＴＵ／ｍｌ培养液；初步的纯化研究得到了具抗凝生物活性的ｒＨＶ１纯品，ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一条带。结论：重组水蛭素变异物１的活性表达及其分离纯化研究填补了国内空白，为研制国产高效重组抗凝药物带来希望。

重组水蛭素RHV3间接竞争ELISA方法的建立

BSA为载体偶联重组水蛭素RHV3,制备的完全抗原免疫新西兰兔,获得了高效价多克隆抗体,间接竞争ELISA方法学测定RHV3的含量。本方法的线性范围为10~1280ng/ml,灵敏度为1.15ng/ml,且具有良好的灵敏度,精密度与回收率。