杜仲Ref基因密码子偏好性分析

杜仲是世界上唯一的硬橡胶树种,是能够替代三叶橡胶的最具开发潜力的胶源植物。本研究以杜仲胶合成下游途径Ref基因为研究对象,运用Codon W和CUSPS等研究Ref基因的密码子组成特点及使用偏好性。研究结果表明,杜仲Ref基因的GC含量为49%,密码子第三位碱基的GC含量为59%;杜仲Ref基因有28个偏好使用的密码子,其中约60%(17个)的密码子以G/C结尾;与大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草的基因组密码子使用偏好性比较,杜仲与拟南芥基因组密码子的使用偏性更为接近,拟南芥更适合作为Ref转基因的受体。本研究为预测杜仲Ref基因的异源表达,适宜表达系统的选择以及Ref基因密码子的改造以提高其在宿主中的表达,进行有效的基因功能验证提供理论参考。

桦木尘提取液对小鼠肺组织脂质过氧化及REF-1基因表达的影响

目的 观察桦木尘对小鼠肺组织脂质过氧化和氧化还原相关基因REF 1表达的影响。方法 采用桦木尘水和有机提取液 ,建立小鼠肺肿瘤短期诱发实验二阶段模型 ,将染毒小鼠处死后分为染毒正常肺组织组、肺乳头状腺瘤组织组、肺腺瘤组织组和肺混合型腺瘤组织组 ,另将溶剂组设为对照组。TBA法检测组织匀浆脂质过氧化物 ,免疫组织化学染色法检测REF 1基因的表达。结果 所有染毒组肺组织匀浆TBARS显著高于溶剂对照组 ,其中 ,肺乳头状腺瘤组、肺腺瘤组和肺混合型腺瘤组P <0 0 1 ,染毒正常肺组织组P <0 0 5 ;与染毒正常肺组织组相比 ,肺乳头状腺瘤组织和肺腺瘤组织组TBARS升高 ,P <0 0 5。溶剂对照组和染毒正常肺组织REF 1蛋白免疫组织化学染色反应为阴性 ,肺乳头状腺瘤表现为强烈的核着色 ,肺腺瘤和肺混合型腺瘤则表现为核和胞浆着色。结论 桦木尘的毒作用机制可能与其改变REF 1蛋白的氧化还原调控功能 。

siRNA沉默APE1/Ref-1基因增强人胰腺癌细胞株对吉西他滨的敏感性

背景:人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(APE1/Ref-1)基因与肿瘤的化放疗抵抗和预后密切相关,是肿瘤基因治疗的理想靶点。目的:以RNA干扰技术靶向沉默人胰腺癌细胞株APE1/Ref-1基因,观察该方法对细胞增殖和凋亡的影响及其能否增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。方法:将靶向APE1/Ref-1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞株SW1990,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测APE1/Ref-1基因和蛋白表达,CCK-8检测细胞增殖情况,流式细胞仪和Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况。结果:转染APE1 siRNA后,SW1990细胞APE1/Ref-1 mRNA和蛋白表达显著减低,蛋白表达抑制率为55.4%±3.6%;24 h、48 h和72 h时细胞增殖抑制率分别为41.7%±2.8%、24.8%±3.7%和21.3%±9.8%;吉西他滨组、si-APE1组和联合组均可见明显细胞凋亡,联合组早期凋亡率显著高于两者单用和空白对照组(19.8%±3.5%对7.7%±1.1%、8.4%±1.0%和2.7%±1.4%,P<0.05),凋亡核形态学变化最为明显。结论:沉默APE1/Ref-1基因能抑制SW1990细胞增殖,促进细胞凋亡,显著提高细胞对吉西他滨的敏感性。RN Ai沉默APE1/Ref-1基因联合吉西他滨化疗可能成为胰腺癌治疗的新的选择。

家蚕Aly/REF的基因克隆、序列分析及其细胞定位

RNA和输出因子结合蛋白(RNA and export factor binding proteins,REF/Aly)参与RNA的稳定、加工和输出。本研究参照已公开的家蚕Bombyx mori aly序列(GenBank登录号:DQ497195.1),通过RT-PCR克隆了家蚕aly/ref基因(Bmaly/ref)。测序结果显示,该基因的开放读码框为765bp,编码254个氨基酸残基,BmAly/REF与黑腹果蝇Drosophila melanogaster、小鼠Mus musculus的同源体的氨基酸序列一致性分别为49.7%和52.7%。结构预测结果显示,BmAly/REF具有REF家族的与RNA结合的结构域RRM,N和C端分别具有REF-N和REF-C基序。进化分析结果显示,昆虫的ALY/REF聚为一类,BmAly/REF与赤拟谷盗Tribolium castaneum、意大利蜜蜂Apismellifera的Aly/REF较为接近。将Bmaly/ref基因克隆进pGS21a(+)载体进行原核表达,重组蛋白免疫小鼠,获得鼠抗BmAly/REF多抗。免疫荧光实验结果显示,BmAly/REF在细胞质和细胞核中均有分布,但主要分布在细胞核中。芯片数据分析显示Bmaly/ref基因在家蚕幼虫5龄第3天各组织中均有较高水平的表达。研究结果显示BmAly/REF可能在RNA的核输出方面发挥作用,为进一步探讨BmAly/REF的功能奠定了基础。

采用组织芯片技术研究APE/Ref-1在胃癌中的表达及其意义

目的检测APE/Ref-1在胃癌中的表达及意义。方法收集60例胃癌和27例癌旁5 cm胃黏膜,用组织芯片(tissue m icro-array)和免疫组织化学法检测APE/Ref-1基因的表达,并分析APE/Ref-1与胃癌临床病理指标之间的关系。结果APE/Ref-1在胃癌和正常胃黏膜组织中呈胞核、胞质或核质共表达。在胃癌组织中,胞核阳性率为91.7%,胞质阳性率为21.7%,核质阳性率为20%;在胃正常黏膜组织中,胞核阳性率为92.6%,胞质阳性率为78%,核质阳性率为63%。胃癌和胃正常黏膜组织相比,胞核阳性率变化不明显(P>0.05),但胞质阳性率和核质阳性率均有显著性差异(P<0.05)。结论APE/Ref-1在胃黏膜组织中普遍表达,以胞核表达为主。APE/Ref-1在胃癌胞质表达水平的降低可能在胃癌的发生、发展中起重要作用。

46,XY女性性反转患者分子遗传学诊断

目的探讨46,XY女性性反转患者的发病机制。方法应用PCR扩增SRY基因;PCR产物通过限制性酶切-单链构象多态性方法检测未知突变;基因测序以进一步明确突变。结果11例46,XY女性患者中检出2例SRY基因缺失,9例46,XY女性患者PCR扩增出现609bp特异性片段,通过限制性酶切-单链构象多态性方法检测发现其中1例患者单链电泳带发生变异;基因克隆测序分析表明HMG盒内第244位核苷酸的位置存在点突变(A→T),导致第82位密码子发生错义突变,由原来编码天冬酰胺Asn(AAT)变为编码酪氨酸Tyr(TAT)。结论SRY基因的研究有助于阐明46,XY女性性反转的发病机理,为临床确诊提供科学依据。

46XY女性性反转综合征一例sry基因的错义突变分析

目的探讨46XY女性性反转综合征患者发病的分子机制。方法应用荧光原位杂交技术(FISH)、聚合酶链反应(PCR)扩增、限制性内切酶分析、单链构象多态性分析及基因测序技术对1例46XY女性性反转综合征进行sry基因的错义突变分析。结果本例FISH证实为X、Y染色体结构,无嵌合体存在;PCR扩增出现609 bp特异性片段;限制性内切酶分析及单链构象多态性分析发现单链电泳带发生变异;且基因克隆测序分析证实HMG盒内第244位核苷酸位置存在点突变(A→T),造成第82位密码子由原来编码天冬酰胺Asn(AAT)变为编码酪氨酸Tyr(TAT),发生错义突变,以致出现女性表型。结论 sry基因在性别决定中起主导作用,对46XY女性患者应在sry基因检测的基础上寻找其他相关病因,以进一步了解其发生性反转的分子遗传学机制,为判断真实性别提供依据。

大鼠肝移植术后早期肝脏损害与Ref-1蛋白的表达

目的 观察大鼠肝移植术后早期肝组织内氧化还原因子1（redox factor-1,Ref-1）蛋白表达与肝脏损伤的关系.方法 将150只Wistar大鼠动物分为三个组,肝移植组、假手术组和空白对照组.分别于肝移植术后3、6、9、12、24 h取材,采用免疫组织化学方法检测移植后各时间肝组织Ref-1蛋白表达,同时通过血清生化指标、组织病理学分析研究Ref-1蛋白表达的意义.结果 血清学检查显示,肝移植术后3 h AST、ALT显著升高,术后6 h降低.病理学分析显示：术后24 h内,部分肝组织结构不清,肝细胞变性,肝窦扩张充血,炎细胞明显浸润.肝损伤较重.免疫组化检测显示,肝移植后早期肝实质细胞内Refl蛋白增高.9h达高峰,以后逐渐下降.结论 肝移植术后发生肝损伤以术后6 h为最重,之后损伤程度逐渐减轻,这是由于移植术后缺血再灌注损伤,激活Ref-1的表达明显增加,修复了由于缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡.

巴西橡胶树REF/SRPP家族基因的克隆及表达分析

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳是天然橡胶的主要来源,橡胶延伸因子(REF)和小橡胶粒子膜蛋白(SRPP)作为胶乳中的两大主要蛋白,被认为参与了橡胶的合成和调控。目前,NCBI蛋白数据库已经登录了巴西橡胶树REF/SRPP家族的6个成员,我们通过研究又获得8个新的REF/SRPP基因家族成员,Hb REF154、Hb REF221、Hb REF296、Hb REF542、Hb SRPP178、Hb SRPP203、Hb SRPP216、Hb SRPP234。这14个成员编码蛋白都具有保守的REF结构域,有两个成员还具有ATP合酶亚基结构域,一个成员具有甲基结合结构域。进化分析显示橡胶树REF/SRPP家族成员与产胶植物REF/SRPP家族成员在进化上较为接近。q PCR分析发现该家族成员都响应割胶刺激表达升高,除Hb REF138外其它成员都响应乙烯处理表达降低。通过shotgun数据分析发现,除Hb REF221外的13个成员都存在于橡胶粒子或C-乳清组分中,Hb REF138、Hb REF154、Hb REF175和Hb REF258主要存在于橡胶粒子中,Hb REF542、Hb SRPP216是橡胶粒子中所特有的,Hb REF296和Hb SRPP200是C乳清中所特有的。该研究结果揭示了REF/SRPP家族成员及其基本的表达特性,为深入研究该家族成员在巴西橡胶树产胶中的具体作用提供了一定的基础。