尿酸对人肾小管上皮细胞氧化应激和TGF-β表达的影响

目的观察尿酸对人肾小管上皮细胞氧化应激和TGF-β表达的影响,并探讨其可能作用靶点与机制。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,分别加入不同浓度的尿酸(UA,240、480、720μmol/L)干预48 h后收集细胞;应用Western blot和免疫荧光化学法对转化生长因子(TGF-β)、抗增殖因子(PHB)蛋白表达进行细胞亚定位及半定量分析。MitoSOX染色检测活细胞线粒体中活性氧(ROS)的产生;分光光度计检测细胞上清液中丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。结果 Western blot和免疫荧光结果显示,240μmol/L尿酸干预HK-2细胞48 h,TGF-β、PHB蛋白均较正常组无明显改变,480μmol/L尿酸干预HK-2细胞,TGF-β表达升高,而PHB较前降低;尿酸浓度为720μmol/L时,TGF-β上调与PHB下降更加显著。线粒体中ROS的产生量也在480μmol/L尿酸干预48 h时明显升高,且随尿酸刺激浓度升高继续上调;240μmol/L尿酸刺激细胞48 h,细胞上清中MDA含量、T-SOD活性较正常组无明显差异,480μmol/L尿酸干预HK-2细胞48h,MDA含量上升、T-SOD活性降低,尿酸浓度为720μmol/L时,上述变化更为显著。结论尿酸可诱导肾小管上皮细胞氧化应激反应,并使TGF-β蛋白表达上调,其机制可能与抑制线粒体相关蛋白PHB表达,使线粒体ROS合成增多有关。

血管紧张素Ⅱ对肾小管上皮细胞凋亡的影响及冬虫夏草对其的干预作用

目的：研究冬虫夏草提取液（Cordyceps sinensis,C.sinensis）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肾小管上皮细胞凋亡的保护机制。方法：C.sinensis（0,5,10,20,40 mg/L）与10-8mol/L AngⅡ共同孵育NRK-52E 24,48,72 h,了解C.sinensis对细胞增殖的影响,确定最佳干预浓度;取AngⅡ（0,10-12,10-10,10-8,10-6mol/L）与NRK-52E共同培育24 h及10-8mol/L AngⅡ与NRK-52E共同培养24,48,72 h,观察AngⅡ对NRK-52E凋亡的影响,确定AngⅡ最佳干预浓度、时间后设立对照组,AngⅡ（10-8mol/L）组,AngⅡ（10-8mol/L）＋C.sinensis（40mg/L）组,AngⅡ（10-8mol/L）＋福辛普利（10-5mol/L）组和AngⅡ（10-8mol/L）＋C.sinensis（40 mg/L）＋福辛普利（10-5mol/L）组,培养24 h后进行实验。MTT法检测不同浓度C.sinensis（0,5,10,20,40 mg/L）对NRK-52E作用24,48,72 h后的增殖情况,流式细胞仪Annexin V/PI双染检测凋亡率,比色法测定caspase-3酶活性。结果：C.sinensis（10~40 mg/L）在一定范围内可呈浓度依赖地促进培养的肾小管上皮细胞增殖（P〈0.05）;AngⅡ呈浓度（10-10~10-6mol/L）和时间（12~24 h）依赖地诱导NRK-52E凋亡率增加,caspase-3酶活性增加（P〈0.05）。C.sinensis（10~40 mg/L）能部分地抑制AngⅡ诱导的NRK-52E凋亡和降低caspase-3酶活性（P〈0.01）,与福辛普利对细胞凋亡的抑制无明显区别,二者联合用药效果与单用效果差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：C.sinensis对AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞凋亡具有一定抑制作用,可能与抑制NRK-52E中caspase-3的激活有关。

三七总苷对尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞外基质分泌及降解的影响

目的探讨三七总苷(PN S)对尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞外基质(ECM)分泌及降解的影响,为临床上应用PN S延缓慢性肾衰竭(CRF)的进展提供理论依据。方法无菌条件下收集40份尿毒症病人血清和20例正常人血清,用相差显微镜、扫描电镜结合细胞角蛋白18(CK-18)免疫组化鉴定人肾小管上皮细胞株HK-2。应用消化法检测HK-2细胞培养上清液中羟脯氨酸水平,EL ISA方法检测HK-2细胞培养上清液中纤连蛋白(FN)、金属蛋白酶-1(MM P-1)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(T IM P-1)蛋白分泌量,RT-PCR方法检测MM P-1和T IM P-1 mRNA表达。结果10%尿毒血清组与正常对照组相比,HK-2细胞培养上清液中胶原蛋白和FN分泌量显著增高,MM P-1/T IM P-1基因表达和蛋白分泌的比值降低,而PN S 400、600、800 m g/L可使尿毒血清增加的HK-2培养上清液胶原蛋白分泌量回降;200、400、600、800 m g/L可使FN分泌量回降;100、200、400、600、800m g/L可使尿毒血清降低的MM P-1/T IM P-1基因表达和蛋白分泌的比值回升。结论在体外实验中,PN S可降低尿毒血清诱导的人肾小管上皮细胞胶原蛋白及FN的分泌,升高MM P-1/T IM P-1基因表达和蛋白分泌的比值,促进ECM降解,从而有效延缓人肾小管-间质纤维化的进展。

高糖对肾小管上皮细胞表达CTGF的影响及P38MAPK通路在其中的作用

目的探讨高糖对人肾小管上皮细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA及蛋白表达的影响,以及p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)信号途径在其中的作用。方法以高糖刺激体外培养的人肾小管上皮细胞株HKC,应用RT-PCR,免疫组化、间接免疫荧光、Western blotting等分析技术,检测高糖刺激24、48、72、96h,以及20d时HKC表达CTGFmRNA及蛋白的影响,并观察以SB203580特异性阻断p38MAPK信号传导途径后上述过程的变化。结果体外培养HKC的CTGFmRNA与蛋白含量极低,高糖刺激48h后HKC表达CTGFmRNA水平达峰值,以后逐渐下降,96h时接近正常水平,但长期(20d)高糖刺激的HKC,其表达CTGFmRNA水平稳定高于正常对照组2倍。而随高糖刺激时间的延长,HKC细胞表达CTGF蛋白水平进行性升高,长期(20d)持续高糖刺激可使CTGF蛋白表达水平达到正常组的5倍左右。SB203580能显著抑制高糖引起的CTGFmRNA及蛋白的高表达。结论持续高糖刺激可以引起体外培养的人肾小管上皮细胞表达CTGF显著升高,提示CTGF高表达是糖尿病肾病肾小管间质纤维化发生的重要环节,而p38MAPK信号途径可能参与了这一过程。

高表达PTEN抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

目的研究PTEN高表达对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的抑制及其信号传导机制。方法脂质体介导含人全长PTEN基因或空载体转染人肾小管上皮细胞(HKC细胞)48 h,倒置荧光显微镜检测PTEN转染组及空载体转染组绿色荧光蛋白表达;Western blot检测正常组、PTEN转染组、空载体转染组中PTEN蛋白表达;RT-PCR检测3组中PTEN mRNA表达。然后将实验分为正常组、TGF-β1刺激组(给予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1组(PTEN基因转染后给予TGF-β1刺激)、空载体+TGF-β1组(空载体转染后给予TGF-β1刺激),Western blot检测各组细胞E-cad-herin、α-SMA、Akt、p-Akt表达水平。结果PTEN基因及空载体转染HKC细胞48 h后可见明显绿色荧光蛋白表达;PTEN转染组PTEN蛋白及PTEN mRNA表达较正常组及空载体转染组细胞均显著上升(均P<0.05)。在正常组、TGF-β1刺激组、PTEN+TGF-β1组、空载体+TGF-β1组中,TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组较正常组E-cadherin表达明显下降(均P<0.05),而α-SMA及p-Akt表达显著上升(均P<0.05);PTEN+TGF-β1组较TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组α-SMA及p-Akt表达明显下降(均P<0.05),而E-cadherin表达上升(均P<0.05);各组细胞Akt表达水平差异不明显(P>0.05)。结论PTEN通过阻止PI3K/Akt通路活化而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化。

萝卜硫素对肾小管上皮细胞氧化应激及Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的:探讨萝卜硫素(SFN)对肾小管上皮细胞(HK-2)的氧化应激及核转录因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶(HO)-1信号通路的影响。方法:体外培养HK-2细胞,将细胞分为空白对照组、H_2O_2处理组、H_2O_2+10μmol·L^(-1)SFN组、H_2O_2+20μmol·L^(-1)SFN组和H_2O_2+40μmol·L^(-1)SFN组;测定HK-2细胞中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽(GSH)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)的活性;RT-PCR和Western Blot法分别检测Nrf2和HO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,H_2O_2处理组中MDA、NO含量明显升高,GSH水平和SOD酶活性显著降低(P<0.05);经高、中、低3种浓度的萝卜硫素处理后MDA、NO含量显著降低,GSH水平显著升高,SOD酶活性也显著升高,Nrf2和HO-1mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论:萝卜硫素有抗HK-2细胞氧化应激损伤的作用,其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。

血管紧张素Ⅱ诱导肾小管上皮细胞Toll样受体4和炎症因子表达

目的探讨Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)所模拟的高血压肾损害微环境中的作用机制。方法 NRK-52E细胞按AngⅡ浓度梯度(10^(-6)~10^(-10)mol/L)培养24h以确定最佳干预浓度,按时间梯度(6~48h)分组培养选择最佳干预时间;同时建立稳定转染TLR4特异RNAi质粒的NRK-52E细胞株。免疫细胞化学及RT-PCR检测TLR4表达水平,ELISA检测上清IL-6及TNF-α水平。结果 10^(-6)~10^(-9)mol/L的AngⅡ均可诱导NRK-52E细胞中TLR4 mRNA明显上调,其中10^(-7)mol/L组作用更为显著;6h即可见TLR4 mRNA水平显著增高,高峰维持12~24h;同时IL-6、TNF-α表达亦上调。TLR4特异性RNA干扰可显著抑制NRK-52E中TLR4的mRNA表达,逆转AngⅡ对IL-6、TNF-α表达的上调作用。结论 AngⅡ可诱导NRK-52E细胞中TLR4及IL-6、TNF-α的表达,阻断TLR4可抑制相关炎症因子的表达,提示TLR4可能通过诱导微炎症反应而参与高血压肾损害。

肾缺血再灌流损伤过程中肾小管上皮细胞色素氧化酶活性变化及TAD防治作用的研究

本实验选用大鼠一侧肾切除，对侧肾缺血６０ｍｉｎ动物模型，用组织化学方法观察再灌流１５ｍｉｎ，２４ｈ髓质外带肾小管上皮细胞色素氧化酶活性的变化及还原型谷胱甘肽（ＴＡＤ）对它们的影响。结果发现６０ｍｉｎ肾缺血后再灌流可致细胞色素氧化酶活性呈进行性降低。给ＴＡＤ能一定程度地保护细胞色素氧化酶活性。提示氧自由基可能损害细胞色素氧化酶活性，细胞色素氧化酶活性降低在肾缺血再灌流损伤中可能起重要作用。

别嘌醇对2型糖尿病小鼠肾小管间质prohibitin表达与细胞凋亡的影响

目的探讨抑制尿酸药物别嘌醇对2型糖尿病db/db小鼠肾小管上皮细胞prohibitin表达及细胞凋亡的影响。方法将T2DM db/db小鼠随机分为:db/db小鼠对照组(db/db组)、db/db小鼠+别嘌醇50 mg·kg-1·d-1治疗组(db/db+A组);将db/m小鼠作为对照组(db/m组),干预12 w后检测血糖、血尿素氮、血尿酸、血甘油三酯、24 h尿蛋白定量水平;电镜下观察肾小管上皮细胞病理改变;Western印迹及免疫组化法检测肾皮质抗增殖因子(prohibitin)、凋亡诱导因子(AIF)的定位与表达水平;分光光度计检测肾皮质丙二醛(MDA)的含量;原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL法)检测肾小管间质细胞凋亡情况。结果①12 w末,db/db组小鼠血糖、血尿酸、血甘油三酯、血尿素氮、24 h尿蛋白定量、肾组织匀浆MDA含量较db/m组均有不同程度的升高(P<0.05),而db/db+A组血尿酸、血尿素氮、24 h尿蛋白定量、肾组织MDA含量均较同时期db/db组降低(P<0.05)。②免疫组化与Western印迹检测结果均提示,db/db组肾皮质prohibitin蛋白表达量较db/m组明显降低(P<0.01),db/db+A组表达比db/db组有所增强(P<0.01)。db/db组肾皮质AIF蛋白表达明显高于db/m组(P<0.01),db/db+A组表达比db/db组有所降低(P<0.01)。③电镜下db/db组小鼠肾小管上皮细胞线粒体可见肿胀、空泡变,嵴结构消失等病变,db/db+A组上述病变减轻。④TUNEL检测结果:db/db组小鼠肾小管上皮细胞及间质细胞凋亡数量较db/m组明显增多,db/db+A组肾小管上皮细胞凋亡率较db/db组降低。结论别嘌醇可抑制T2DM小鼠肾小管间质细胞凋亡,其机制可能与其降低血尿酸水平后提高肾组织prohibitin的表达,减少局部氧化应激反应,抑制AIF增多并向核内转位有关。

人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠肾小管上皮细胞缺氧损伤的干预作用

目的:观察体外缺氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡情况以及分离纯化人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSCs-exosomes)对其干预作用。方法:将体外培养的NRK-52E细胞随机分为对照组、缺氧损伤模型组和hucMSCs-exosomes(0.5,1.0 mg/ml)预处理组。随后进行细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期以及凋亡率的变化。结果:与对照组相比,模型组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P<0.01),Bcl-2/bax表达下调(P<0.01),细胞周期S期阻滞以及凋亡细胞比例明显增多。而hucMSCs-exosomes预处理组可明显改善缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,改善细胞周期和凋亡细胞的比例(P均<0.05)。结论:NRK-52E在缺氧损伤时有明显的细胞凋亡,而hucMSCs-exosomes预处理可能通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤。本实验可为进一步研究hucMSCs-exosomes在组织损伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础。

高糖对人肾小管上皮细胞和系膜细胞表达血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1的影响

目的研究高糖作用下人近端肾小管上皮细胞(HKC)和系膜细胞(HMC)中血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1(SGK1)的表达,并初步探讨SGK1在介导高糖致肾细胞(HKC和HMC)过度合成细胞外基质(ECM)中的作用。方法将HKC和HMC细胞分别分为正常对照组(NG组,5.5mmol/LD-葡萄糖)、高糖组(HG组,25mmol/LD-葡萄糖)和渗透浓度对照组(MG组,19.5mmol/L甘露醇和5.5mmol/LD-葡萄糖)。SGK1mRNA水平及蛋白水平的检测分别采用RT-PCR方法和Western印迹方法。培养液中纤连蛋白(FN)水平检测采用ELISA方法。结果HKC和HMC中均存在SGK1基因和蛋白的表达。HMC中SGK1的表达明显高于HKC(P<0.01)。高糖刺激8h后,两种细胞SGK1表达均明显升高(P<0.01);同时,甘露醇也上调HKC和HMCSGK1的表达(P<0.01),但其作用明显弱于高糖(P<0.05)。FN在高糖环境下表达上调,且高峰出现时间滞后于SGK1。结论高糖能促进近端肾小管上皮细胞和系膜细胞SGK1的表达,并可能通过SGK1介导的信号转导途径在糖尿病肾病ECM积聚中发挥重要作用。