携带Rep1风险位点的帕金森病患者血液mRNA表达差异研究

目的探索携带SNCA基因（synuclein alpha）Rep1风险位点的帕金森病（Parkinson’s disease,PD）患者外周血基因表达差异。方法采用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）结合直接测序法检测128例维吾尔族帕金森病人（PD组）及160例维吾尔族健康体检者（对照组）SNCA启动子区Repl多态性,并按照PD患者年龄差异进行分组比较,年龄≤50岁为EOPD组,年龄〉50岁为LOPD组。进一步筛选携带Rep1风险位点的3例PD患者及3例非携带健康体检者,用Trizol提取外周血总RNA,分别与Illumina表达谱芯片进行杂交实验。结果EOPD组与年龄相匹配的对照组比较,Rep1位点CA碱基重复12次（2型等位基因）的频率分别为21.4%、6.9%,差异具有统计学意义（χ2=12.67,P=0.00）。与对照组比较,EOPD患者外周血中差异表达2倍以上的基因有359条,包括SNCA基因在内的122条表达上调2倍以上。其中与SNCA基因表达异常有关的多巴胺代谢和胆碱能突触信号通路改变最显著（FE=3.64,P=0.046;FE=5.57,P=0.005）。结论 Repl位点2型等位基因与EOPD的发生有关,携带该位点2型等位基因患者外周血SNCA表达异常升高。

维吾尔族帕金森病与SNCA基因Rep1位点片段多态性的关联研究

目的探索帕金森病(Parkinson’s disease,PD)易感基因α-突触核蛋白基因(α-synuclein,SNCA)的Rep1位点片段多态性差异与维吾尔族(维族)PD易患性的关联。方法聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)结合直接测序法检测SNCA启动子区Repl的多态性。结果共发现Rep1位点0、1、2型3种等位基因,0/0、1/1、2/2、0/1、0/2、1/2共6种基因型;病例组和对照组等位基因及基因型频率差异无统计学意义(χ2=2.43,P=0.30;χ2=4.28,P=0.51);按照年龄分组比较,早发型帕金森病组(Early-onset Parkinson’s disease,EOPD,年龄≤50岁的PD患者)2型等位基因频率(21.4%)高于对照组等位基因频率(6.9%),差异有统计学意义(χ2=12.67,P=0.00);晚发型帕金森病组(Late-onset Parkinson’s disease,LOPD,年龄>50岁的PD患者)与对照组比较,各基因型差异和各等位基因差异无统计学意义(χ2=2.23,P=0.41;χ2=5.33,P=0.12)。结论SNCA基因启动子区片段多态性位点Rep1的等位基因2与维吾尔族EOPD的易患性有关。

番鸭细小病毒Rep1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

Rep蛋白在番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)感染中的作用尚不清楚。研究将MDPV的Rep1基因克隆入p ET-28a原核表达载体并转化BL21(DE3)大肠杆菌,在IPTG诱导下成功表达了分子量约为82 ku的目的蛋白,菌体分析表明目的蛋白主要以包涵体存在。将重组蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对Rep1蛋白的多克隆抗体。在间接免疫荧光试验中,Rep1多克隆抗体能与鹅胚成纤维细胞上增殖的MDPV特异性发生反应,免疫印迹试验则显示Rep1多克隆抗体能够在MDPV感染的GEF中识别出两条蛋白条带Rep1和Rep2。结果表明制备的Rep1多克隆抗体具有良好反应特异性,为深入研究Rep蛋白在MDPV感染中的作用奠定了基础。

鹅细小病毒Rep1蛋白的原核表达及抗体制备

为深入研究鹅细小病毒(GPV)Rep蛋白的功能,采用PCR方法扩增出完整的Rep1基因,并克隆入原核表达载体pET-28a(+)。将重组质粒pET28-Rep1导入到大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE分析表明:37℃下经1mmol·L^(-1) IPTG诱导4h,Rep1蛋白可获得高效表达。重组蛋白经切胶免疫BALB/c小鼠制备针对Rep1蛋白的多克隆抗体。经间接免疫荧光检测,1∶1 000稀释的多抗能特异性识别在鹅胚成纤维细胞上增殖的GPV抗原,说明所制备的多抗具有良好反应原性,可用于后续针对Rep蛋白的相关功能研究。

维吾尔族和汉族帕金森病与α-突触核蛋白基因Rep1位点片段多态性的关系

目的 探讨帕金森病（PD）易感基因α-突触核蛋白（SNCA）的Rep1位点片段多态性差异维吾尔族、汉族间PD的相关性.方法 聚合酶链反应（PCR）结合直接测序法检测SNCA启动子区Rep1多态性.结果 Rep1位点0、1、2 3种等位基因,0/0、1/1、2/2、0/1、0/2、1/2 6种基因型;等位基因2频率在PD组中高于对照组分别为9.7％和6.4％）,差异有统计学意义（x2=7.81,P＜0.05）;早发型帕金森病（EOPD）组与年龄≤50岁对照组比较,等位基因2在两组间的频率分别为22.5％和7.3％.两组差异有统计学意义（x2=16.89,P＜0.01）;EOPD组与晚发型帕金森病（LOPD）组比较：在EOPD组中等位基因2的发生频率明显高于LOPD组,分别为22.5％、6.1％,差异有统计学意义（x2=35.52,P＜0.01）;不同民族间PD组与对照组、不同性别间PD组与对照组、晚发性PD组与年龄＞50岁的对照组、PD组间维、汉比较、PD组间男、女比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 SNCA基因启动子区片段多态性位点Rep1的等位基因2与EOPD的易患性明显相关,而与民族、性别无明显相关.