布鲁氏菌Rev.1株接种不同条件制备TSA培养基验证试验

布鲁氏菌病是严重威胁人类健康的动物源性人畜共患病之一,动物布鲁氏菌病防治以预防为主。目前国内布鲁氏菌病疫苗有S2、A19、M5等,国际上还有S19、Rev.1等株疫苗使用,其中以羊种M5株和Rev.1株稳定性最不好。TSA是胰蛋白胨大豆琼脂培养基(也称胰酪大豆胨琼脂培养基),为商品化培养基,是布鲁氏菌Rev.1株适宜生长的培养基。选择不同琼脂浓度TSA培养基平板在不同条件(温度和时间)放置后接种布鲁氏菌Rev.1株,培养96 h后观察菌落生长情况并进行菌落结晶紫染色。通过对比分析发现,TSA培养基平板的湿度是影响变异检验结果准确性的重要因素,同时明确了布鲁氏菌Rev.1株所需TSA培养基的制备方法。

羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失株的构建及鉴定

为获得毒力较弱且能够区分疫苗免疫与自然感染的羊种布鲁氏菌候选疫苗株,本研究构建羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失突变株。分别扩增Rev.1疫苗株VirB12基因上下游同源臂序列以及卡那霉素抗性基因,采用融合PCR方法将3个基因片段连接构建突变盒,连接至pMD19-T载体,电转化入布鲁氏菌Rev.1感受态细胞筛选阳性克隆,获得Rev.1-ΔVirB12突变株。Rev.1-ΔVirB12连续传代15代未发生回复突变。羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1-ΔVirB12的构建为羊种布鲁氏菌疫苗研制奠定了基础。

动物布鲁氏菌Rev.1疫苗研究进展

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人畜共患病,对公共卫生和畜牧养殖业构成严重威胁。布鲁氏菌Rev.1疫苗研制于20世纪50年代中期,并在欧洲、中东和蒙古等地区被广泛应用于小反刍动物的布病防控,一度被认为是防控小反刍动物布病最有效的疫苗。但是,Rev.1疫苗仍存在毒力偏强及毒力不稳定等现象,其安全性值得关注。从Rev.1疫苗背景、生物学特性、疫苗使用情况以及存在的不足等几个方面进行了综述,以期为Rev.1疫苗的科学应用和布病相关疫苗的开发提供借鉴。

羊种布鲁氏菌Rev.1突变株在BALB/c鼠中的免疫保护评价

为评价Rev.1-ΔKan-Vir B12突变株在BALB/c鼠中的免疫保护力,以Rev.1为参照,用Rev.1-ΔKanVir B12接种BALB/c小鼠,免疫45 d后用布鲁氏菌16M强毒株攻毒,15 d后取BALB/c鼠脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。结果显示:BALB/c鼠免疫攻毒15 d后,Rev.1-ΔKan-Vir B12免疫组和Rev.1免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P<0.05),而Rev.1免疫组与Rev.1-ΔKan-Vir B12免疫组之间的克脾指数差异不显著(P>0.05)。结果表明,羊布鲁氏菌Rev.1-ΔKan-Vir B12突变株与其亲本Rev.1株的免疫保护性无明显差异,具备作为布鲁氏菌病标记疫苗的潜力。

持续运动和间歇运动对高脂喂养大鼠肝脏Rev-erbα和SCD1表达的影响

目的探讨低强度持续运动和大强度间歇运动对高脂喂养大鼠肝脏Rev-erbα和SCD1表达的影响及其肝脏脂质代谢调节的分子生物学机制。方法 37只雄性Sprague-Dawley大鼠分为对照饮食安静组(CS组)、高脂饮食安静组(HS组)、高脂饮食持续运动组(HE组)和高脂饮食间歇运动组(HI组)。HE组和HI组分别采用低强度持续运动和大强度间歇运动方式训练,每周5 d,周期为10周。检测体质量、血清学指标、肝脏中性脂质含量以及靶分子Rev-erbα、SCD1基因和蛋白表达量。结果 HE组和HI组体质量、血脂和血糖含量较HS组降低,QUICKI指数显著增加;HI组中性脂质含量较其它高脂组显著降低。HS组SCD1 mRNA表达量较CS组明显增加;Rev-erbαmRNA表达量显著下降。HI组SCD1 mRNA表达量明显降低,Rev-erbαmRNA表达量升高;且HI组与其它高脂组均存在显著差异。靶分子蛋白表达量与转录水平基本一致。结论大强度间歇运动预防高脂饮食喂养大鼠机体代谢异常和肝脏脂质沉积,其效果明显优于低强度持续运动方式,Rev-erbα对SCD1的代谢调控可能是影响高脂喂养大鼠肝细胞脂质代谢调节的重要分子机制。

HIV-1 B'/C亚型Rev蛋白的表达、纯化与抗体制备

目的:为方便实验室工作中对HIV-1 B'/C亚型Rev蛋白的检测,制备相应的Rev蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1 B'/C亚型流行株的rev基因按大肠杆菌优势密码子进行改造后人工合成,在原核系统中与pET30a(+)载体中的His.Tag、Trx.Tag及S.Tag进行融合表达,目的蛋白经Ni2+金属螯合层析柱纯化后用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果与结论:合成基因在原核系统中融合表达得到相对分子质量约18×103的融合蛋白,目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的36%;用纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹及间接免疫荧光检测结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1 B'/C亚型的Rev蛋白能产生特异性反应,可用于检测HIV-1 B'/C亚型Rev蛋白的表达。

HIV-1 Rev蛋白及相关抑制剂

病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression,Rev)是人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)转录过程中不可缺少的调控蛋白。Rev与病毒mRNA的Rev应答元件(Rev response element,RRE)相互作用,加速mRNA向核外转运。Rev缺乏或者不能进入细胞核,未剪接和部分剪接的mRNA将在核内完全降解,导致HIV-1的复制被阻断。Rev在HIV-1复制周期中起着重要的反式调节作用,是艾滋病药物研究的新靶点之一。本文综述了Rev蛋白的结构、功能以及针对Rev-RRE作用机制的相关抑制剂的研究进展。

稳定表达HIV-1辅助蛋白Rev的THP-1细胞模型的建立和鉴定

Human immunodeficiency virus-1(HIV-1)辅助蛋白在其感染和艾滋病发病过程中起着非常重要的作用。Regulator of expression of virion proteins(Rev)作为HIV-1辅助蛋白之一,可以调节病毒结构蛋白mRNA出核转运和蛋白表达,对于病毒的复制至关重要。为研究Rev蛋白对靶细胞表型和功能的影响,本实验采用电穿孔的方法,将HIV-1的rev基因导入THP-1细胞,通过流式分选结合G418筛选的方法建立稳定表达Rev蛋白的细胞模型;并通过RT-PCR、荧光观察及流式检测的方法,在mRNA和蛋白两个水平对所建立的细胞模型进行鉴定。结果证实rev基因成功导入了THP-1细胞并稳定表达,为后续rev基因产物与细胞相互作用的研究提供了平台。

布鲁菌疫苗株Rev.1全基因序列的测定与分析

为促进布鲁菌病Rev.1疫苗及相关疫苗的研发,该研究提取Rev.1疫苗株核酸,应用PacBio平台进行全基因序列测定与分析。结果表明,Rev.1疫苗株基因组大小约3299187 bp,G+C含量为57.2%,组装为染色体1、染色体2两条环状基因组,大小分别为2121370、1177817 bp,G+C含量分别为57.2%、57.3%。将其Ery、BLS和VirB10基因序列与9株GenBank上发表的布鲁菌参考菌株的Ery、BLS和VirB10基因序列进行比较分析,存在不同程度的差异,同源性为97.4%~100%。

布氏菌病活疫苗（Rev.1株）冻干保护剂工艺的研究

布氏菌病活疫苗(Rev.1株)的冻干工艺借鉴、采纳布氏菌病活疫苗(S2株)成熟的冻干工艺及菌液的配比,对冻干保护剂的选择进行了优化。我们选择蔗糖明胶保护剂和蔗糖脱脂乳保护剂,保护剂与布鲁氏菌Rev.1株菌液以16的比例混合,冻干后测定其活菌含量。结果显示,3批使用蔗糖脱脂乳保护剂的不同配比比例的冻干疫苗活菌数分别为12×10^9CFUmL、12.44×10^9CFUmL、12.65×10^9CFUmL;使用蔗糖明胶再加入终浓度约1%硫脲的不同配比比例的冻干疫苗活菌数分别为12.34×10^9CFUmL、12.62×10^9CFUmL、12.91×10^9CFUmL;使用蔗糖明胶的不同配比比例的冻干疫苗活菌数分别为12.22×10^9CFUmL、12.64×10^9CFUmL、12.8×10^9CFUmL。3种冻干保护剂对冻干疫苗的活菌含量影响无明显差异,但使用蔗糖明胶保护剂制备冻干疫苗时加入适量硫脲可适当增加冻干疫苗的耐热性,因此我们选择10%明胶、20%蔗糖冻干保护剂与菌液以1∶6配比比例混合,再加入终浓度约为1%的硫脲作为布氏菌病活疫苗(Rev.1株)的冻干工艺。

一个新的HIV-1治疗靶点-Rev蛋白

目的研究治疗AIDS的创新药物-Rev蛋白抑制剂体外抗HIV感染作用及其作用机制。方法Rev是HIV-1病毒进行复制的一个十分重要的蛋白质。Rev的生物学功能决定它是一个理想的开发抗AIDS药物的靶蛋白。本研究以S.Pom be酵母菌株为模型建立HIV载量测定方法用于筛选Rev蛋白抑制剂,并应用分子生物探针等方法在分子生物学和生物化学水平解析其抑制Rev蛋白质传送的作用机理和活性部位。结果1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯在1mμg/m l的浓度下完全阻止S.Pombe酶母的融合蛋白从细胞核向细胞质的传送,在2mμM的浓度下对HIV增殖(p24产生量)的抑制率为85%,且不显示任何细胞毒性,其分子式为C13H14O4,分子量为234.25,具有抗HIV感染活性的1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯为S构型,活性部位为1-acetoxy-2-ene。结论1'-乙酰氧基胡椒酚乙酸酯作为Rev蛋白抑制剂抗HIV感染治疗艾滋病新战略创新药物的研究开发具有深远的意义。

羊种布鲁氏菌疫苗株PCR-RFLP鉴定方法的建立

为建立一种羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株PCR-RFLP鉴定方法,利用羊种布鲁氏菌Rev.1具有链霉素抗性的特性,选取与链霉素抗性相关编码核糖体蛋白S12的rps L基因为模板设计引物,经PCR扩增后,将产物进行Nci I酶切,发现羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1出现约500 bp条带,而不具有链霉素抗性的羊种布鲁氏菌株16M则出现384 bp条带。结果表明,PCR-RFLP方法能够用于羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株的鉴定,这为今后区分羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1免疫与野株感染提供了基础。

布鲁菌BAB基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究以布鲁菌Rev.1株基因组为模板,扩增BAB基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),获得重组质粒pET-30a-BAB,对重组质粒进行原核表达,经Western blotting检测后,利用表达产物构建检测布鲁菌病的间接ELISA方法。结果表明,本试验成功克隆并表达了BAB基因,纯化表达产物经SDS-PAGE分析显示,本研究获得较纯的重组BAB蛋白;Western blotting试验表明,表达蛋白可与布鲁菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;以重组BAB蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BAB抗体的间接ELISA方法。确定最佳包被条件:BAB蛋白包被量0.25μg/mL,血清稀释度为1∶400;封闭液为3%猪源明胶;二抗稀释度为1∶6000;显色时间为10 min。应用建立方法对临床40份羊血清进行检测,计算得出临界值为0.607。即当待检血清的P/N≥1.5,且D450 nm≥0.607时,判定为阳性,当D450 nm≤0.561时,判定为阴性,当0.607<D450 nm<0.561时,判定为疑似值,需要进行复检。与虎红平板试验和试管凝集试验比较,阳性符合率为100%,阴性符合率为71.88%,总符合率为77.5%。

以Rev依赖性凋亡增强HIV-1 gp160的抗原性

目的 检测Rev(HIV的调控基因 )依赖性肿瘤坏死因子受体 (TNFR 1)和gp16 0双重表达质粒pDM12 8 TNFR 1(pT12 8)的凋亡诱导功能。方法 采用基因枪转导及流式细胞仪检测新质粒的表达功能。结果 新结构具有特异的选择性表达作用。当Rev存在时 ,能间接表达TNFR 1,明显诱导HeLa细胞凋亡 ,使绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P <0 .0 1)。等质量转染时 ,TNFR 1表达量少于Hup6 0TNFR 1的pDC30 2 (pT6 0 ) ,故间接表达不及单纯pT6 0的直接表达 ,绿荧光细胞百分率显著高于pT6 0转染组 (P <0 .0 1)。培养 40h ,才有明显杀伤功能并接近单纯pT6 0 ,差异无显著性 (P>0 .0 1)。单纯pT12 8不能直接表达TNFR 1,绿荧光细胞百分率非常显著地高于单纯pT6 0转染组 (P<0 .0 1) ,接近阴性对照 ,培养 40h时差异无显著性 (P >0 .0 1)。当AD8或pMD +pRnv存在并表达Rev时 ,pT12 8均能表达TNFR 1,杀伤HeLa细胞 ,绿荧光细胞百分率非常显著地低于阴性对照 (P <0 .0 1)。pT12 8与pRev或AD8转染人正常的角质生成细胞时 ,能表达TNFR 1,诱导细胞凋亡。培养 72h后 ,阴性对照和单纯pT12 8组的绿荧光角质生成细胞数皆显著地超过pT12 8+pRev和pT12 8+pAD8组 (P <0 .0 1)。结论 pT12

人类免疫缺陷病毒感染细胞的Rer蛋白依赖性凋亡引导

目的:以人类免疫缺陷病毒(HIV)调节蛋白Rev与Rev反应区(RRE)的高亲和性建立引导HIV感染细胞凋亡的结构。方法:用分子克隆技术合成含RRE和肿瘤坏死因子受体-1(TNF-R1)的Rev依赖性凋亡引导质粒,流式细胞仪检测质粒表达。结果:新质粒pDM128-TNF-R1(pT128)HindIII内切有3.1、2.7、1.0和0.87kb片段;聚合酶链反应(PCR)法检测示TNF-R1的1360bp片段。DNA测序法确认其准确性。单纯Hup60TNF-R1在pDC302(pT60)转染Hela,TNF-R1表达可明显杀伤Hela(P<0.01),Rev存在时,pT128也能表达TNF-R1杀伤Hela(P<0.01),但不及pT60的作用(P<0.01);无Rev时,pT128不表达TNF-R1,不杀伤Hela(P>0.01)。单纯Rev不杀伤Hela(P>0.01)。pT128与pRev共转,TNF-R1表达较pT60慢(P<0.01),40h后才接近单纯pT60。结论:新质粒具有Rev依赖性表达作用,进而引导Rev表达细胞凋亡。

9400 TEU集装箱船绑扎桥检验要点

为给船员和码头工人提供安全的绑扎作业环境、确保集装箱安全系固和降低坠海风险,以《货物堆装和系固安全实用规则》(CSS Code)最新修正案MSC.1/Circ.1352/Rev.1生效后首批建造的9 400 TEU集装箱船绑扎桥为例,对该通函相关技术要求和现场检验关注事项进行解读和总结。对国内船厂更好地执行通函要求,不断提高超大型集装箱船的建造质量,给出技术提示。

关于核级控制阀的商品级部件升级方法的介绍

基于核级控制阀的安全性和经济性的考虑,首先介绍了核级部件设计制造过程的等级划分,重点介绍了核级控制阀设计制造过程中的商品级部件升级方法(Commercial Grade Dedication Method)的依据标准EPRI NP-5652&TR-102260 Rev.1①(Plant Engineering:Guideline for the acceptance of Commercial-Grade Items In Nuclear Safety-Related Applications),并对商品级部件升级的验收方法进行了讨论。

关于操舵试验推算方法的思考

介绍了SOLAS操舵试验要求和IACS对操舵试验的解释,对IACSUISC246提出的等效推算方法进行分析,得出对一般船舶推算因子简单有效的结论。同时也基于实践,提出其他推算方法。

以病毒RNA核转运为靶点的抗HIV-1药物筛选模型的建立及应用

目前,临床使用的抗AIDS一线药物主要是HIV逆转录酶抑制剂和蛋白质酶抑制剂。但是,由于这类药物价格昂贵、严重的副作用、毒性、耐药性等问题日益严重,发展新作用机制的抗HIV-1药物已成当务之急。因此,本课题以HIV-1病毒RNA核转运关键蛋白Rev为靶点,建立了新型抗HIV药物筛选模型,以期寻找具有新作用机制的抗病毒药物。在筛选模型中,选择了由HIV-1病毒偏爱性密码子所编码的GFP(GFPHIV)作为报告基因,用于快速简便地分析样品对Rev依赖的RNA核转运的影响。选取抑制剂来普霉素B作为模型的阳性对照对本模型进行了初步评价,计算出Z'因子为0.8220。上述结果初步证明了该模型可用于新型抗HIV药物的筛选。对3000个化合物进行初筛,阳性率为9.3%,复筛阳性率为7.3%。通过抗病毒活性的测定实验以及对阳性化合物进行免疫印迹检测,最后发现IMB7C7这个化合物以病毒RNA核转运为靶点,是具有较好效果的特异性抑制剂。

HIV－1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件

目的研究HIV-1载体中的一些元件如Rev和Tat蛋白对其骨架的转录及外源基因表达水平的影响。方法将HIV-1表达GFP载体（FUGW）单独或分别与Rev蛋白表达质粒（pLP2）、Tat蛋白表达质粒（pcDNA3.1-Tat），及表达Rev和Tat蛋白的质粒（△8．9）等摩尔共转染人293T细胞后，经实时定量RT-PCR、FACS、荧光显微镜镜检等方法检测，比较其表达量。结果Rev与RRE结合后，载体骨架及外源基因的转录是单独转染FUGW时的3倍，Tat与TAR结合后，则提高其骨架及外源基因的转录近4倍，而Rev和Tat蛋白的协同作用，其转录本则可提高至6倍。FACS和荧光显微镜镜检也显示GFP蛋白表达量明显提高。F-TPO载体（HIV-1载体乳腺特异表达促血小板生成素）与△8．9在小鼠乳腺上皮细胞HC-11共转染和表达，则TPO蛋白的表达量接近pcDNA3．1-TPO载体的8倍。结论HIV-1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件，可提高其骨架的转录和外源基因的表达，且该现象并不依赖于细胞类型和外源基因的种类。