1例RHD-CE(3-7)-D基因重组与RHCE变异型患者的血清学与分子生物学分析

目的 研究分析1例Rh血型弱D、弱cE患者的血清学与分子生物学特征,为该类患者的临床安全输血提供实验依据。方法 采用微柱凝胶卡法对患者红细胞进行ABO、RhDCcEe抗原的鉴定,同时采用试管法进行血型复核,抗人球蛋白卡法筛查不规则抗体;采用PCR-SSP法对RhDCcEe(RhD、RhC、Rhc、RhE、Rhe)基因型进行检测;三代全长测序技术对RHD/RHCE基因序列进行测序分析。结果 微柱凝胶卡法鉴定ABO、RhD、RhCcEe血型抗原的结果为:A抗原(-)、B抗原(-)、RhD(1+)、RhC(4+)、Rhc(1+)、RhE(1+)、Rhe(4+)、对照孔(-);试管法ABO、RhD、RhCcEe抗原鉴定该患者表型为:A抗原(-)、B抗原(-)、RhD(w+)、RhC(4+)、Rhc(w+)、RhE(w+)、Rhe(4+),对照管(-);抗人球蛋白卡法筛查患者不规则抗体阴性;PCR-SSP法血型基因分型RhDCcEe结果:RhD(+)、RhC(+)、Rhc(+)、RhE(+)、Rhe(+);RHD/RHCE基因结果:RHD单倍体1为外显子1-10全缺失,而单倍体2为外显子RHD-CE基因重组融合,且确认其重组类型为RHD-CE(3-7)-D,起点在外显子2(g.20238-20312之间),终点在外显子8(g49184-50480之间),同时RHCE基因第6外显子存在新碱基点突变RHCE*cE(827C>A)。结论RHD-CE(3-7)-D基因重组融合与RHCE*cE(827C>A)新等位基因突变可能引起D、cE血型抗原弱表达,为临床安全输血提供了重要的实验数据支持。

RhD双群患者的血清学及分子生物学分析--附1例报道

目的对1名配血困难的RhD双群(double population,DP)患者进行血清学及分子生物学分析,解决其RhD血型鉴定及临床用血问题。方法用毛细管离心法分离患者红细胞,对近心端、远心端红细胞分别进行ABO和Rh血型鉴定,以及直接抗人球蛋白试验;对患者血浆进行不规则抗体筛选及鉴定以及交叉配血试验;采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)检测RHD基因合子型,采用序列特异性聚合酶链反应(PCR-SSP)进行RHD和RHCE基因型检测。结果血型鉴定的结果显示该患者血型为B型,RhD及RhCE的c和E血型抗原均为DP,直抗阳性,抗体筛查及鉴定结果显示血浆中含有抗-D;PCR-RFLP结果显示该患者RHD基因盒子型为D-/D-纯合子,即为RHD编码基因缺失型所致的RhD阴性;PCR-SSP的结果也显示该患者RHD编码基因外显子均缺失,RHD基因型为RHD*01N.01/01N.01,RHCE基因型为Ccee。结论本例患者在急救情况下输注了RhD阳性血液,之后被误判为RhD阳性血型,实则为RhD阴性血型。本中心在血型鉴定为DP时,利用分子生物学方法对患者进行了Rh血型准确鉴定,为该患者的精准临床用血提供了依据。

郑州地区RhD变异型献血者分子生物学分析

目的研究郑州地区RhD变异型献血者血清学特征及基因突变机制。方法选择2023年1月—2023年12月送至本实验室的1619名RhD阴性献血者为研究对象,应用试管法和微柱凝胶间接抗球蛋白试验方法进行RhD阴性确认试验及RhCE表型检测。采用RHD基因扩增和Sanger测序检测RhD变异型标本基因型。结果RhD阴性确认试验共检出RhD变异型69例,比例为4.26%(69/1619)。RhCE表型分别为ccEe、Ccee、CcEe、CCee。包含17种基因型,15种D变异型表型。RHD^(*)weak partial 15等位基因最多(33例),频率为47.83%(33/69),主要表型为ccEe;其次是RHD^(*)DVI.3等位基因20例,频率为28.99%(20/69),主要表型为Ccee。RHD^(*)weak partial 15/RHD^(*)01EL.01杂合子3例,频率为4.35%(3/69),皆为CcEe表型。其他罕见基因型共13例,频率为18.84%(13/69)。抗筛阳性3例,比例为4.35%(3/69)。女性献血者2名,皆有孕产史,经抗体鉴定为抗-D;男性献血者1名,为抗-M。结论郑州地区RhD变异型献血者中RHD^(*)weak partial 15基因型最常见,其次为RHD^(*)DVI.3基因型。对保障安全供血,指导临床精准输血具有重要作用。

新疆地区249例RhD变异型基因分型研究

目的研究分析新疆地区RhD变异型标本的RHD基因分型特征。方法收集2006年1月—2023年6月常规RhD阴性确认工作中RhD抗原盐水法阴性或弱阳性、间接抗人球蛋白试验(IAT)阳性的RhD变异型标本249例,并做RhCE抗原分型,提取血液基因组DNA,采用PCR-SSP或qPCR方法对RHD基因进行分型,必要时用基因测序验证。结果249例RhD变异型标本中,检出弱D15型(RHD*15)155例(62.25%)、DⅥtype 3型(RHD*06.03.01)30例(12.05%),弱D1型(RHD*01W.1)7例(2.81%)、弱D17型(RHD*01W.17)2例(0.80%)、DⅥtype 4型(RHD*06.04)3例(1.20%)、DⅤtype 2型(RHD*05.02)9例(3.61%)、DⅢa型(RHD*03.01)1例(0.40%),以及DEL1227A(RHD*01EL.01)6例(2.41%),未能确定RHD等位基因型别,有待进一步基因测序分析的标本有36例。RHD*15的常见Rh表型为ccEe。结论新疆地区RhD变异型的RHD基因以RHD*15为最常见,并存在丰富的遗传多态性。

广州地区RhD阴性献血者Del表型及基因型分析

目的研究广州地区RhD阴性献血者D放散型(Del)分布、表型及基因型以了解本地区DEL血型分子生物学背景。方法对2021年11月1日—2022年6月30日期间广州地区献血者采用盐水法初筛为RhD阴性血液进行间接抗人球蛋白试验(IAT)血清学确认、采用RhCE分型卡确定RhCE表型,对1146例确认RhD阴性所有C+(n=459)以及随机抽取部分C-标本(n=175)进行吸收放散(Del)筛查(共634例);提取Del阳性标本DNA进行高分辨熔解曲线分析法(HRM)实时荧光PCR检测RHD基因c.1227位点基因情况;对HRM检测RHD^(*)1227位点无突变标本采用限制性片段多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)扩增后产物作PstⅠ酶切,进行电泳分析RHD基因合子型;sanger法进行RHD基因进行外显子测序(exon 1-10),采用SeqMan软件分析基因突变情况;采用第3代单分子测序技术对可疑Del阳性标本进行RHD全基因分析。结果634例确认RhD阴性标本吸收放散试验结果显示Del表型占36.1%(229/634),占总RhD确认阴性的20%(229/1146);229例DEL的RhCE分型分别为Ccee 181例,CCee 40例,CcEe 7例,ccEe 1例,HRM结合RHD盒子型分析结果显示170例RHD基因为RHD^(*)1227A/01N.01、32例为RHD^(*)1227A/1227G,26例为RHD^(*)1227A/1227A、6例为RHD^(*)1227G/1227G(其RHD基因测序结果显示1例为弱D12型、4例为D-和1例RHD^(*)01EL.02)。结论广州地区献血者DEL个体基因型以RHD^(*)1227A/01N.01为主且其RhCE表型均为C+的特征;HRM可作为常规筛查“亚洲型”DEL血型基因的分子生物学方法。

RhD阴性孕产妇与HDFN发生的相关性及影响因素分析

目的 通过对RhD阴性孕产妇腹中胎儿和分娩的新生儿发生胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of the fetus and newborn,HDFN)的相关指标对比分析,为预防和治疗HDFN提供参考和指导。方法 收集我院2018年1月—2022年12月分娩的RhD阴性孕产妇737名,比较新生儿是否发生RhD血型不合、ABO血型不合导致的HDFN及其影响因素,发生RhD-HDFN和发生ABO-HDFN的相关影响因素。分析发生RhD-HDFN和发生ABO-HDFN患儿的实验室指标差异;分析IgG抗-D效价≤16和≥32的孕产妇分娩的新生儿发生RhD-HDFN的实验室指标差异。结果 737名RhD阴性孕产妇中,发生RhD-HDFN的母婴ABO血型相同或相容者比率88.89%(40/45)显著高于母婴ABO血型不相容者11.11%(5/45)。母体二次妊娠及以上发生RhD-HDFN比率93.33%(42/45)显著高于ABO-HDFN 60.66%(37/61)者。母体IgG抗-D效价≥32者分娩的新生儿血红蛋白(hemoglobin,Hb)最低值低于母体IgG抗-D效价≤16者(χ^(2)=5.61,P<0.05),母体IgG抗-D效价≥32者分娩的新生儿血清总胆红素(total bilirubin,TBil)峰值高于IgG抗-D效价≤16者(χ^(2)=4.471,P<0.05)。结论 RhD阴性孕产妇中,母婴ABO血型相同或相容及孕产次≥2者,相应新生儿更易发生RhD-HDFN,母体IgG抗-D效价≥32者发生新生儿溶血的严重程度显著高于抗-D效价≤16者。

RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL型红细胞短期内引起高效价抗-D的同种免疫研究

目的通过对1例RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL红细胞后诱发同种抗-D免疫的研究分析,探讨RhD阴性患者输注DEL型策略。方法采用血清学方法进行ABO及Rh系统血型抗原检测、不规则抗体筛查及鉴定,高分辨熔解曲线和基因测序分析检测DEL型的RHD基因分型。结果受血者为O型,RhD阴性。供血者为RHD 1227G>A突变的“亚洲型”DEL,Rh表型为Ccee。受血者输血后抗体筛查阳性,并鉴定为抗D和抗C,抗D效价512,抗C效价128。结论RhD阴性患者输注“亚洲型”DEL红细胞会引起抗-D同种免疫。因此对于RhD阴性献血者应加强DEL型的筛查,必要时可以增加RHD基因检测以保障输血安全。

重庆地区RhD变异型无偿献血者的基因多态性及其表型研究

目的对重庆地区22例RhD变异型无偿献血者标本进行Rh血型血清学检测和三代基因测序,了解重庆地区RhD变异型的表型分布及其基因分型。方法选择2023年1—8月本中心参与无偿献血的人群作为研究对象。使用传统血清学方法对其进行RhD表型鉴定,确定为RhD变异型后使用D-screen试剂盒对其进行RhD不同抗原表位的检测。此外,提取其基因组DNA,使用叠瓦式引物设计进行多段扩增、拼接获得RHD基因全长序列进行三代测序检测,并用SnapGene软件对序列结果进行分析。结果在22例RhD变异型中,8例为DVI 3型(36.36%),其存在RHD-CE(3-6)-D杂交等位基因;6例部分弱D15型(27.27%),主要发生的突变为c.845G>A;6例亚洲型Del(27.27%),主要发生的突变为c.1227G>A,还有1例弱D17型发生的突变为c.340C>T和1例推测为部分D(c.491A>T,p.Asp164Val,错义突变)。结论重庆地区无偿献血人群中最常见的RhD变异型为DVI 3型,使用SMRT三代测序技术可以获得RhD变异型单倍体全长。

毛细管离心技术在RhD抗原混合外观患者D抗原鉴定中的应用

目的探讨毛细管离心技术在RhD抗原呈混合外观患者D抗原鉴定中的应用可行性。方法对11例RhD抗原呈混合视野的患者红细胞进行清洗,制备压积红细胞。之后用毛细管离心法分离血细胞,分别向近端患者自身红细胞和远端红细胞加入抗D试剂鉴定RhD抗原。根据献血者代码追踪输入红细胞的RhD抗原。结果经毛细管离心,1例患者RhD抗原阴性,8例患者RhD抗原阳性,其余两例患者RhD抗原仍为混合视野。结论毛细管离心技术可有效分离患者新生红细胞,准确鉴定患者RhD抗原,为临床输血提供安全保障。

Rh系统抗-D与抗-E抗体共同致新生儿溶血病的研究分析

目的:研究1例Rh系统2种不规则抗体(抗-D、抗-E)同时存在导致新生儿溶血病。方法:通过临床资料提供,对产妇进行血型分析,不规则抗体筛查及抗体特异性鉴定,抗体效价分析;对新生儿进行直接抗人球蛋白试验、游离试验、放散试验及抗体特异性分析。结果:产妇不规则抗体阳性,抗体为Rh系统抗-D与抗-E,IgG抗-D效价为512,IgG抗-E效价为2;新生儿直接抗人球蛋白试验阳性、放散试验检出抗-D和抗-E抗体,游离试验检出抗-D抗体。结论:经新生儿三项实验诊断新生儿溶血病成立,积极给予对症治疗,患儿康复出院。

芜湖地区初筛RhD阴性献血人群RHD基因分型特征

目的:了解芜湖地区献血者初筛RhD^(-)汉族人群的RHD基因分型的分子机制及分布特征。方法:收集2021年8月-2022年8月芜湖市中心血站无偿献血人群初筛RhD^(-)样本共210例,对样本的RHD基因第1、10号外显子进行PCR扩增,确定样本是否存在RHD基因。对含有D基因的82例样本RHD基因1-10号外显子进行PCR扩增及合子型分析,对55例含全部RHD外显子样本进行Sanger测序以确定基因型。结果:在210例RhD^(-)标本中,128例(60.38%)为RHD基因缺失;27例存在部分RHD外显子,包括2例RHD*DVI.3/RHD*01N.01,24例RHD*01N.04/RHD*01N.01和1例RHD-CE(2-10)/RHD*01N.01;55例含有全部RHD外显子,包括4例RHD*01/RHD*01N.01,6例RHD*15/RHD*01N.01,1例RHD*01 W.72/RHD*01N.01,1例RHD*15/RHD*01EL.01,39例RHD*01EL.01/RHD*01N.01,余下4例样本根据合子型分析确定不存在RHD基因缺失、测序显示存在1227G>A突变。结论:芜湖地区献血人群RhD^(-)D基因的分子机制存在多态性,其中RHD*01EL.01和RHD*15为本地区主要D变异型,本研究结果为本地区RhD血型鉴定和临床输血提供理论基础。

北京地区初筛RhD阴性人群血清学和RHD基因分型特征研究

目的研究北京地区初筛RhD阴性人群RHD基因分型,分析不同基因型的血清学特征及Rh表型分布规律。方法收集本院2022年8月—2024年1月通过微板法或微柱凝集法初筛RhD阴性标本204例,使用盐水试管法进行Rh抗原表型鉴定,微柱凝集-间接抗人球蛋白技术进行RhD阴性确认试验,PCR-SSP法和测序技术进行RHD基因分型检测,计算各表型频率和基因频率。结果204例初筛RhD阴性标本Rh血清学表型分布为ccee 112例(54.90%)>Ccee 73例(35.78%)>CCee 9例(4.41%)>ccEe 6例(2.94%)>CcEe 4例(1.96%)。本研究共检出7种RHD基因型,检出数量由高至低依次为129例(63.24%)RHD^(*)01N.01、44例(21.57%)RHD^(*)01EL.01、26例(12.75%)RHD^(*)01N.03、2例(0.98%)RHD^(*)01N.16、1例(0.49%)RHD^(*)06.03.01、1例(0.49%)weak RHD^(*)15,1例(0.49%)RHD^(*)13.01/RHD^(*)01N.01。Rh血型抗原基因频率及表型分布,符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。结论北京市初筛RhD阴性人群RHD基因具有多态性,最常见的RhD阴性基因型为RHD^(*)01N.01,RHD变异型为RHD^(*)01EL.01。该研究可为临床实施基因型匹配输血提供数据支持。

RhD抗原表达强度对输血相容性检测低值阳性质控品制备的影响

目的通过血清学结果比较RhD抗原表达强度差异,确定低值阳性质控品弱凝集强度的基准红细胞。方法以1500倍稀释抗-D分型试剂,使用微柱凝胶法对RhD(+)红细胞进行检测,挑选RhD抗原表达强度弱和强的标本分别为低值阳性质控品弱凝集强度的基准红细胞并进行验证。结果使用稀释后抗-D分型试剂对10份RhD(+)红细胞进行检测,其中8份凝集强度为1+、2份为±。以凝集强度呈1+的红细胞为基准,确定其凝集强度呈1+时抗-D分型试剂倍比稀释的最大稀释倍数,作为低值阳性质控品制备标准,则其与RhD抗原表达强度低的红细胞反应凝集强度极弱呈±,难以保障其控制界限性质稳定。以凝集强度呈±的红细胞为基准,重新确定其凝集强度呈1+时抗-D分型试剂倍比稀释的最大稀释倍数,作为低值阳性质控品制备标准,结果符合质控品设置要求。结论以RhD抗原表达强度低的红细胞为基准,设置低值阳性质控品弱凝集强度,可避免质控品因靶值较低而造成失控。

微柱凝胶检验法在RhD、ABO血型抗原鉴定中的应用价值分析

目的探讨微柱凝胶检验法在RhD、ABO血型抗原鉴定中的应用价值。方法120例需行RhD及ABO血型鉴定患者,将所有取得的血样分为两份,分别使用试管法及手工微柱凝胶免疫检验法(微柱凝胶检验法)对血型进行分析。比较两种检测方式的鉴定结果。结果120例患者血样经试管法及微柱凝胶检验法检测后,结果均发现ABO阳性112例(其中A型34例,B型33例,AB型11例,O型34例),ABO阳性率为93.33%;RhD阴性1例,RhD阴性率为0.83%。两种方法的抗原检测结果符合率为100.00%,两种方法检测血型结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论微柱凝胶检验法应用在RhD、ABO血型抗原鉴定中,操作简便,准确率高,值得在临床中推广应用。

RhD抗原鉴定技术在临床输血中的应用效能及安全性研究

目的:研究不同RhD抗原鉴定技术在临床输血中应用效能及安全性。方法:选取2021年7月—2023年2月济南市章丘区人民医院需要输血的患者1126例作为研究对象,进行血清学试验及RhD抗原鉴定。对微柱凝胶抗球蛋白法(MGCT)、凝聚胺法(MPT)、盐水法的效能进行比较,使用受试者工作特征曲线分析三种检测方法的效能。结果:谱细胞检测RhD抗原(Rh+)1115例,无RhD抗原(Rh−)11例。MGCT的Kappa值为0.816,与谱细胞检测一致性最高。MGCT曲线下面积>MPT、盐水法,MPT曲线下面积>盐水法。结论:三种RhD抗原鉴定技术中,MGCT在RhD抗原鉴定中表现最佳,有利于保证临床输血安全。

RhD(-)孕产妇的RhD同种免疫分析及围产期孕妇新生儿溶血病的监测、预防和治疗

目的分析304名RhD(-)孕产妇RhD同种免疫发生情况,探讨RhD(-)孕产妇抗-D产生的影响因素,建立正确的围产期孕妇RhD新生儿溶血病的监测、预防和治疗方案。方法采用标准血清学方法对3975名孕产妇及其丈夫进行ABO及RhD抗原鉴定。对RhD抗原鉴定为阴性的标本,进一步采用间接抗球蛋白方法检测RhD抗原,以排除或确认弱D型或部分D表型。对所有RhD(-)孕产妇及其丈夫进行CcEe表型的血清学分型。采用抗球蛋白方法对所有RhD(-)孕产妇标本进行不规则抗体初筛,对初筛阳性者进一步用鉴定细胞做抗体鉴定及抗体效价测定并采用PCR-SSP方法确定是否为DEL型。结果 3975份孕产妇标本中304份经鉴定为RhD(-),其中29份产生了抗-D,本组调查中RhD(-)孕产妇抗-D产生的比例为9.54%。29名产生抗-D的RhD(-)孕产妇中,夫妇ABO血型相合者24名(82.76%),不合者5名(17.24%)。经分子生物学方法鉴定,29名产生抗-D的Rh(-)孕产妇均排除DEL表型。结论 RhD孕产妇RhD同种免疫的发生受多种因素的影响,DEL型孕产妇产生抗-D的几率较低。应及时、定期监测RhD围产期孕妇的抗-D水平,对未产生抗-D的孕妇应给予抗-D免疫球蛋白治疗,对已产生抗-D的孕妇,应密切监测其抗-D水平,并在孕期及新生儿出生后给予正确治疗。

cis基因交换形成RHD-CE(2～9)-D等位基因

以往通过基因组DNA分析,分别在高加索人和中国人中观察到少数Rh阴性个体存在RHD基因第1和第10外显子,但是该等位基因形成的具体分子机制尚有争论。分别针对RHD基因mRNA的5′和3′非编码区设计一对特异性引物,通过逆转录PCR(RTPCR)和cDNA测序,分析2例RHD基因阳性(拥有第1和第10外显子)、D抗原表型阴性个体的全长mRNA/cDNA序列,同时以1例正常Rh阳性个体(CcDDee)作对照。结果正常Rh阳性个体拥有正常RHD基因mRNA,2名携带RHD基因的Rh阴性个体则均检出存在与正常RHD基因或RHCE基因转录产物相同长度、以及相同外显子构成的mRNA,但该转录子的第1和第10外显子及3′非编码区序列与RHD基因一致,而第2～9外显子全部序列与RHCE(e)基因mRNA相同,表明2名个体均存在RHDCE(2～9)D融合RHD等位基因,即其RHD基因的第2～9外显子被同源RHCE(e)基因替换,导致不能编码正常RhD蛋白,形成个体D抗原阴性表型。

表型为CC或Cc19名RhD(-)中国无关供血者中的RHD基因多态性

目的：探讨ＲｈＤ（－）中国无关供血者中ＲＨＤ基因的基因构成情况。方法：采用ＰＣＲ－ＳＳＰ方法对３４名ＲｈＤ（－）的中国供血者的基因组ＤＮＡ进行研究。主要扩增ＲＨＤ基因外显子２、３、４、５、６、７、９、１０和内含子４以及ＲＨＣＥ基因内含子４。结果：３４名ＲｈＤ（－）中国供血者的ＲｈＣｃＥｅ表型为４例ＣＣｅｅ，１５例Ｃｃｅｅ和１４例ｃｃｅｅ及１例ｃｃＥｅ。在所有表型为ｃｃｅｅ或ｃｃＥｅ的１５例ＲｈＤ（－）个体中，ＲＨＤ基因完全缺失；而在表型为ＣＣｅｅ或Ｃｃｅｅ的１９例ＲｈＤ（－）个体中，ＲＨＤ基因则表现出多态性：８名供血者存在大量正常的ＲＨＤ基因，占４２．１１％；７名供血者表现为部分缺失，占３６．８４％；４名供血者则完全缺失ＲＨＤ基因，占２１．０５％。其中，７名部分缺失均为同一中间缺失，只存在外显子１、２和３非编码区。ＲｈＤ（－）个体携带或部分携带ＲＨＤ基因的表型为ＣＣｅｅ或Ｃｃｅｅ，而无ｃｃｅｅ。结论：在表型为ＣＣ或Ｃｃ的中国供血者中观察到３种ＲＨＤ基因多态性，提示ＲｈＤ（－）个体携带或部分携带ＲＨＤ基因与ＲｈＣ阳性之间有某种关系。因此，将ＲＨＤ基因定型结果应用于临床医学时应特别注意。