米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。

米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对米黑根毛霉脂肪酶(RML)成熟肽基因进行全面密码子优化,以提高RML基因在酵母细胞中表达的水平,并对重组脂肪酶的酶学性质进行了研究。运用重叠延伸PCR合成优化后的RML成熟肽基因,并进一步构建毕赤酵母表达载体p PIC9K-RML,通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株,经G418抗性和PCR筛选获得高拷贝转化重组子。重组酵母菌用0.5%甲醇诱导异源基因表达,在28℃摇瓶培养168 h后酶活力达到122 U/m L,较未优化的原始菌株的表达酶活提高了10倍。重组脂肪酶最适温度为45℃,最适p H值为7,甲醇体积分数为40%以下时重组RML具有较好的稳定性。

丝状真菌米曲霉外源基因表达系统的构建

以米曲霉(Aspergillus oryzae)R IB40的基因组DNA为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增得到启动子、终止子、筛选标记基因等表达元件,依次连接到载体pUC119上,构建了米曲霉的重组表达载体pNMA.将米赫根毛霉脂肪酶基因(RML)连接于pNMA的启动子下,得到表达载体pNMA-RML,通过ApaⅠ酶切线性化转化米曲霉宿主菌A.oryzaeniaD300,得到整合型的阳性转化子A.oryzaeONL1.其培养7天的培养液的上清液在以三丁酸甘油酯为底物的平板上形成清晰的水解透明圈,碱滴定法酶活测定表明培养液酶活可达2.5U/mL,培养液上清液的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱在相对分子质量32 500处有RML的特征条带.这说明RML已经在米曲霉中成功表达,同时证明所构建的米曲霉外源基因表达系统是有效的.

高效絮凝素毕赤酵母表面展示系统的构建

为了获得高效的脂肪酶毕赤酵母表面展示系统,利用来自酿酒酵母絮凝素蛋白Flo1的N端874个氨基酸残基(FS)和C端的1101个氨基酸残基(FL)作为锚定蛋白分别构建了2套载体系统.带有前肽的米黑根毛霉脂肪酶(ProRML)克隆到构建的2套展示载体中,使米黑根毛霉脂肪酶(RML)分别以N端锚定或C端锚定的方式实现在毕赤酵母细胞表面的展示.利用RMLC端的Flag标签,通过流式细胞术和激光扫描共聚焦显微镜检测2套系统中RML在酵母表面的展示情况.研究发现,N端锚定于酵母表面的展示酶FSR以pNPC为底物时,水解活力达到了105.3U/g,大约为C端锚定的展示酶FLR活力的2倍.同时FSR比FLR具有更宽的温度、pH作用范围和更好的热稳定性.与游离酶和固定化酶相比,展示酶FSR也表现出更为优良的热稳定性.结果提示,基于Flo1N端锚定的展示系统更适合展示活性中心近C端的脂肪酶,推动了展示酶的进一步研究和开发.

米黑根毛霉脂肪酶基因的酵母重组表达和Kex2位点改造

米黑根毛霉脂肪酶(RML)具有较高的合成活性、热稳定性、溶剂耐受性以及sn-1,3位置专一性等一系列适合工业化推广的特点。本研究通过密码子优化改造RML编码基因,并将其克隆、转化到毕赤酵母GS115菌株,经诱导发酵156 h,酶活达到3.77 U/mL。为了进一步改善RML脂肪酶的重组表达,通过定点突变的方式去掉潜在的Kex2酶切位点,结果显示:RML突变体表达量均显著低于野生型的RML脂肪酶,表明"-Arg196-Arg197-"序列并不影响RML的重组表达。通过对RML蛋白结构分析,Kex2酶切位点的肽键被包埋在蛋白内部,这表明该位点区域的折叠在进入分泌途径时已基本完成。本研究对异源蛋白的酵母重组表达具有一定参考价值。

米黑根毛霉脂肪酶基因的克隆、表达及活性分析

以米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)为出发菌株,采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取其总RNA,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出米黑根毛霉脂肪酶(RML)结构基因。构建真核重组表达质粒RML-pPIC9K,电转化His+缺陷型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,利用MD-MM平板及PCR方法筛选和鉴定出重组子,进行甲醇诱导表达。结果表明,RML基因能够在巴斯德毕赤酵母中实现高效表达。重组子发酵液经SDS-PAGE分析显示获得了与预期大小(约39 kD)一致的蛋白表达特异条带,用NaOH滴定法测其活性,酶活可达84 U/mL。

两嗜热真菌中国新记录种

在对山东、陕西及云南的标本研究中鉴定出两个嗜热真菌中国新记录种 ,即亚拉巴马枝顶孢 ,米黑根毛霉 ,对其进行了描述和讨论。亚拉巴马枝顶孢的主要特征是其深色菌丝、瓶梗产孢及顶生分生孢子 ;米黑根毛霉的主要特征是产生带假根孢囊梗 ,单孢子培养产生大量接合孢子。研究标本保存在山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。

米黑根毛霉甘露聚糖酶的定向进化、高效表达与应用

为提高米黑根毛霉甘露聚糖酶(RmMan5A)对魔芋粉的水解效率,利用定向进化技术对该酶进行分子改造,经两轮筛选获得了一个对甘露聚糖酶催化效率显著提升的突变体(RmMan5AM2)。该突变体的最适pH为7.0,最适温度为65℃,较野生型甘露聚糖酶提高了10℃。该突变体继承了野生型甘露聚糖酶的高比酶活力,对槐豆胶的比酶活力达10371.4 U/mg。在最适条件下,该突变体对槐豆胶、魔芋粉和瓜尔胶的催化效率分别提高了37.4%、28.9%和34.4%。进一步将该突变体在毕赤酵母中进行高效表达,经过156 h高密度发酵,发酵液胞外酶活力达176000 U/mL,是目前产甘露聚糖酶的最高水平。利用该突变体水解魔芋粉成功制备魔芋甘露寡糖,产物主要为聚合度2~6的甘露寡糖(相对峰面积>85%),总得率为88.5%。该突变体具有优良的酶学性质,对魔芋粉的水解效率显著提升,在魔芋甘露寡糖的酶法制备中具有很大的应用潜力。

固定化米黑根毛霉脂肪酶的制备工艺优化及其酶学性质

以海藻酸钠-羧甲基纤维素钠(CMC)为复合载体,戊二醛为交联剂,探究了包埋-交联法制备固定化米黑根毛霉脂肪酶的最佳工艺条件,并对固定化米黑根毛霉脂肪酶的酶学性质进行分析。结果表明,制备固定化米黑根毛霉脂肪酶的最佳工艺条件为海藻酸钠质量分数2.5%、CMC质量分数1.5%、脂肪酶液浓度800 U/mL、CaCl_(2)质量分数5%、戊二醛质量分数0.03%、交联固定化时间30 min,在此条件下固定化米黑根毛霉脂肪酶的酶活力为245.58 U/g,与游离脂肪酶相比,固定化脂肪酶热稳定性和pH稳定性均有所提高。交联剂戊二醛的添加可以提高固定化脂肪酶的操作稳定性和储存稳定性,在重复使用7次后相对酶活力保持在57.39%,在4℃下存放7周后相对酶活力为61.89%。包埋-交联法制备的固定化米黑根毛霉脂肪酶具有更好的稳定性和适应性,为实现植物油酶法酯化脱酸工业化生产提供参考。

米黑根毛霉脂肪酶基因密码子优化及重叠延伸PCR合成

[目的]对米黑根毛霉脂肪酶基因的密码子进行优化,并采用重叠延伸PCR合成设计的基因序列。[方法]根据毕赤酵母(Pichiapastoris)密码子使用偏好性,对米黑根毛霉脂肪酶成熟肽基因进行全面密码子优化,根据优化后的氨基酸编码序列设计合成30条长度约为48 bp的寡核苷酸片段,并采用重叠延伸PCR法扩增合成全长基因序列。[结果]经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析表明,合成的目的基因与设计的序列相一致。[结论]该研究为脂肪酶基因在毕赤酵母中的构建及后续表达奠定了基础。

游离DHA酯化富集的脂酶催化工艺研究

研究了脂酶催化游离DHA和甘油酯化的工艺。结果表明:以Rhizomucor miehei脂酶催化的一步法工艺的最适条件为FFA∶甘油=1∶3、脂酶量1%和水分5%,其酯化率、三酰甘油(TAG)含量和TAG中DHA富集量分别为71.6%、22.98%和47.53%;以Rhizomucor miehei脂酶催化的二步法工艺和以Rhizomucor miehei脂酶、Alcaligenes sp.脂酶共同催化的混合酶法工艺不能改变TAG中DHA的百分含量,但可显著提高反应的酯化率和TAG含量。其中,二步法工艺可将酯化率和TAG含量分别提高到84.66%和91.86%,而混合酶法工艺则可分别将其进一步增加到97.68%和93.39%。

Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated Genetic Transformation System for Aspergillus awamori

[ Objective ] This study aimed to establish Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation system for Aspergillus awamori and investigate the feasibility of expressing heterologous proteins in A. awamori. [ Method] Appropriate A. awamori host strains were determined according to the secretory protein profile. Selectable marker was selected for genetic transformation by drug sensitivity analysis. The established A. awamori genetic transformation system was used for transformation and expression analysis of Rhizomucor miehei lipase （RML）. The feasibility of using A. awamori to express heterologous proteins was investigated by identification of transformants and property analysis. [ Result~ Based on the analysis of secretory protein profile, A. awamori strains CBS115.52 and CICC2257 were determined as the host strains for heterologous protein expression ; drug sensitivity analysis shows that hygromycin B resistance gene （ HygBr ） is an effective ge- netic seleetable marker; by using Agrobacterium tumefaciens-mediatcd transformation （ATMT） method, the plasmid pHGW-amdS containing HygBr was successfully transformed into A. awamori strain CBS115.52 to establish the genetic transformation system ofA. awamorl with HygBr as selectable marker. RML was transformed into A. awamori and its expression was validated by substrate hydrolysis test, SDS-PAGE and Western blot. [ Conclusion] This study demonstrates that the genetic transformation system of A. awamori mediated by Agrobacterium tumefaciens has potential feasibility for expression of heterologous proteins.

米黑霉脂肪酶基因的高效表达及活性测定

为了实现米黑霉脂肪酶（Rhizomucor miehei Lipase,RML）基因在大肠杆菌中的高效表达,并得到大量的具有生物活性的脂肪酶,首先通过3种方式提高RML在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量：1）低温诱导（16℃）RML表达;2）新型分子伴侣（Skp）与RML N端融合表达;3）载体pET32a上的Trx.tag与RML N端融合表达。其次对各蛋白质进行纯化及活性测定,各种条件得到的RML比活在（226±10~247±10）U/mg。蛋白质表达结果显示：经低温诱导RML的效果最好,纯蛋白质量浓度为0.86 mg/mL,表明诱导温度是影响可溶性蛋白质表达量的关键因素;活性测定结果表明,Skp和Trx.tag与目的基因N端的融合没有影响RML活性中心（C末端）对底物的结合和催化能力。因此,RML不仅在大肠杆菌中得到高效表达,并且保持原有生物学活性,在工业生产中有应用价值。

毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶发酵条件

在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。

米黑根毛霉α-淀粉酶的定向进化、高效表达及在面包中的应用

本研究利用定向进化技术对米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)来源的α-淀粉酶(RmAmy)进行分子改造,随后对突变酶进行高效表达和在面包中的应用。突变酶(mRmAmy)的最适pH和温度分别为5.0和65℃,比野生型下降1.0 pH和10℃;该酶在pH 4.0~10.0和60℃以下稳定。mRmAmy经高密度发酵168 h,酶活力最高达11 900 U/mL。mRmAmy应用于面包制作中,在加酶量为3 mg/kg时,面包比容增加14.4%,硬度减小25.8%。结果表明mRmAmy在烘焙工业中具有很大的应用潜力。

米黑根毛霉脂肪酶的克隆表达及发酵条件优化

米黑根毛霉脂肪酶RML是一种重要的工业用酶,具有非常广泛的应用前景。本研究将人工合成的RML基因rml克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-rml诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,并使用抗生素G418筛选、三丁酸甘油酯-MM板及PCR方法筛选阳性重组工程菌。工程菌发酵液经SDS-PAGE分析、三丁酸甘油酯板鉴定,表明脂肪酶RML在毕赤酵母中获得高效表达,且蛋白分子大小与预期一致。进一步优化了发酵条件,包括对培养基组分、诱导剂浓度和发酵温度等的优化。优化后的培养基组成为:甘油4.0%,(NH4)2SO45.000 g/L,CaSO40.465 g/L,K2SO49.100 g/L,MgSO4.7H2O7.450 g/L;培养条件为:pH值6.0,生长阶段温度30℃,诱导阶段采用22℃低温诱导,诱导期每24 h补加甲醇浓度为3%。优化后,发酵液中的RML活力最高达到116 U/ml,比优化前提高了3.14倍。

根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统的构建

[目的]建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统,探讨利用泡盛曲霉表达异源蛋白的可行性。[方法]从国内主要菌种库中购买泡盛曲霉菌株,根据分泌蛋白图谱分析确定合适的宿主菌,在此基础上通过药物敏感性分析确定遗传转化的选择标记,并利用构建的泡盛曲霉遗传转化体系对米黑根毛霉脂肪酶基因RML进行转化、表达研究,通过转化子鉴定及性质分析考察泡盛曲霉作为异源蛋白表达系统的可行性。[结果]通过分泌蛋白图谱分析确定泡盛曲霉CBS115.52和CICC2257作为异源蛋白表达的宿主菌;药物敏感性试验确定潮霉素抗性基因(HygBr)作为有效的遗传选择标记;在此基础上,利用根癌农杆菌介导的转化方法(agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT),将带有HygBr的质粒pHGW-amdS成功导入泡盛曲霉宿主菌CBS115.52,建立以HygBr为选择标记的泡盛曲霉遗传转化体系。利用该体系,介导米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)的表达载体转化泡盛曲霉,通过底物水解试验、SDS-PAGE及Western blot确定RML基因已在泡盛曲霉中表达。[结论]该研究证明了根癌农杆菌介导转化泡盛曲霉作为异源蛋白的表达体系具有潜在的可行性。

米曲霉产米黑根毛霉脂肪酶高通量筛选方法的建立

为了快速、高效地筛选出高产米黑根毛霉脂肪酶(RML)的米曲霉菌株,利用常温常压等离子体诱变技术(ARTP)对米曲霉孢子进行诱变,优化了高通量检测RML酶活的双指示剂法,建立了24孔板米曲霉高通量培养体系。通过对诱变后的1200孔(36000~48000个孢子)进行高通量筛选,最终筛选出4株米曲霉高产突变株。经由摇瓶验证,突变株Ⅰ7-D6-7、Ⅱ4-4B-5、Ⅲ3-5C-1、Ⅴ7-6C-3酶活分别达到了265.98、240.90、253.52、293.50 U/mL,比出发菌株的酶活(176.52 U/mL)分别提高了50.68%、36.47%、43.61%、66.27%。

促进米黑根毛霉脂肪酶分泌的毕赤酵母内源信号肽的筛选

米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)在造纸、食品、化妆品以及医药等行业应用广泛。本研究通过SignalP 4.1在线预测软件预测出9种具有分泌潜力的毕赤酵母内源信号肽序列:FLO10、CPR5、PRY2、DSE4、NUP145、MSB2、SSP120、FRE2、FLO9。以广泛应用的酿酒酵母α-交配因子(α-mating factor,α-MF)信号肽为对照,考察这九种内源信号肽对增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)和RML在蛋白酶缺陷型PichiaPinkTM表达系统的分泌效果。结果发现FLO10、PRY2、DSE4、MSB2、SSP120、FRE2能有效介导EGFP分泌,且PRY2、DSE4、MSB2、FRE2介导EGFP的分泌水平优于α-MF,分别是α-MF的2.15倍、1.15倍、1.33倍、1.30倍;FLO10、PRY2、DSE4、FRE2能有效介导RML的分泌,且FLO10介导RML的分泌水平最高,是α-MF的1.50倍,说明内源信号肽FLO10更能有效分泌RML。本研究为提高米黑根毛霉脂肪酶在蛋白酶缺陷型毕赤酵母的表达量奠定了一定的基础。

大孔树脂NKA-9负载RML催化高酸价油脂脱酸及制备甘油二酯

本文采用了大孔树脂NKA-9作为载体负载脂肪酶RML,然后用于催化油酸含量为25%的大豆油脂以酶促脱酸并同时制备富含甘油二酯(DAG)的油脂产品。研究采用了扫描电镜(SEM)和X-射线光电能谱仪(XPS)对NKA-9负载酶前后进行了结构表征,结果表明RML已成功负载在NKA-9上。所得固定化酶RML@NKA-9催化油酸含量为25%的大豆油脱酸及DAG制备的优化条件为:反应温度50℃,甘油用量为油脂质量的8%,RML@NKA-9用量为油脂质量的3%,在该条件下反应8 h后达到平衡,此时DAG含量58.95%,游离脂肪酸(FFA)含量降低至1.50%。此外研究了RML@NKA-9的重复利用性,结果表明,RML@NKA-9重复使用4次后其酶活几乎没有损失,重复使用6次后其酶活为初始酶活的49.10%。本研究制备的RML@NKA-9能有效脱除高酸价油脂中的FFA,并获得了可观含量的DAG,具有一定的重复利用性,因此,RML@NKA-9具有较大的应用前景。