血管紧张素Ⅱ对大鼠肝星状细胞收缩及Rho-Rock通路的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠肝星状细胞(HSC)Rock通路的影响机制。方法采用HSC-T6细胞株,给予AngⅡ1μmol/L处理,聚硅酮膜法直观检测HSC的收缩性;另予AngⅡ10μmol/L处理,免疫印迹法检测肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化的表达水平。观察AngⅡ1型受体(AT-1受体)阻断剂伊贝沙坦和Rho激酶特异性抑制剂Y27632对磷酸化MLC表达水平的影响;逆转录聚合酶链反应检测Rock通路Rock2(Rho kinase 2)mRNA的表达。结果AngⅡ可诱导磷酸化MLC蛋白水平的变化,并呈时间依赖性,15min达到峰值后逐渐减低。伊贝沙坦和Y27632处理组可抑制AngⅡ诱导的MLC蛋白磷酸化水平。AngⅡ处理组Rock2mRNA的表达显著增强,伊贝沙坦和Y27632均可抑制Rock2 mRNA的表达。结论AngⅡ可以通过Rock通路来诱导HSC的收缩。

血管紧张素1-7对大鼠肝星状细胞Rho-Rock信号转导通路的影响

目的探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张素1-7(Ang1-7)对大鼠肝星状细胞Rho-Rock信号转导通路的影响。方法采用HSC-T6细胞株,分别给予AngⅡ、Ang1-7、AngⅡ+Ang1-7、Ang1-7+A779 10μmol/L处理,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Rho-Rock通路中Rock2 Rho kinase2)、RhoAGTP、RhoGEF Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors,RhoGEF)的表达。结果 AngⅡ处理组Rock2、RhoAGTP、RhoGEF mRNA的表达显著增强,Ang1-7组Rock2、RhoAGTP、RhoGEF mRNA的表达显著低于阴性对照组。结论 Ang1-7可抑制AngⅡ诱导的Rho-Rock信号通路的表达。

Rho-ROCK抑制在脊髓损伤修复中的作用

Rho信号通路在脊髓损伤的病理生理学中发挥重要作用。脊髓损伤会引发Rho信号通路上调,Rho及其下游激酶的活化触发了生长锥塌陷并显著抑制轴突再生。有研究表明Rho-ROCK信号通路能介导硫酸软骨素蛋白多糖对神经元的抑制作用,而抑制Rho信号通路能减弱这种抑制作用,因此抑制Rho信号通路能促进脊髓损伤后的神经保护及轴突再生。目前已鉴定出C3转移酶能选择性抑制Rho而不影响其它鸟嘌呤三磷酸酶活性,在脊髓损伤的小鼠模型中,C3转移酶能促进胸脊髓半切除后的轴突的生长及运动功能恢复。Rho抑制剂在动物脊髓损伤模型中的神经保护作用也得到证实,Rho抑制剂赛生灵已经在Ⅰ/Ⅱa临床试验阶段用于脊髓损伤后的干预治疗,并且获得了较好的结果。在这篇综述里,我们将简要介绍Rho信号通路及Rho-ROCK抑制在脊髓损伤治疗中的作用。

法舒地尔通过Rho-ROCK通路抑制高糖诱导的单核细胞与内皮细胞黏附

目的观察Rho激酶抑制剂法舒地尔能否抑制高糖诱导的单核细胞(THP-1)与人脐静脉内皮细胞黏附,初步探讨其潜在机制。方法使用荧光显微镜观察荧光标记的THP-1与人脐静脉内皮细胞黏附。血管细胞黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1的mRNA及蛋白表达水平分别通过RT-PCR、Western blot检测。使用Western blot检测RhoA、ROCK-1、p-MYPT及MYPT蛋白表达水平变化。结果法舒地尔显著抑制高糖诱导的THP-1与人脐静脉内皮细胞黏附,并呈剂量依赖性,其中,低浓度法舒地尔(10-6 mmol/L)干预24 h黏附减少约33.4%,高浓度法舒地尔(10-5 mmol/L)干预24 h黏附减少约42.8%(P值均<0.05),干预12 h组趋势相同。法舒地尔显著减低高糖诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1及单核细胞趋化蛋白1的mRNA及蛋白表达水平,并呈时间依赖性和剂量依赖性。高糖显著增加p-MYPT/MYPT比值,而法舒地尔减弱高糖对p-MYPT/MYPT比值的影响,抑制Rho/RCOK通路激活。结论法舒地尔抑制高糖诱导的THP-1与人脐静脉内皮细胞黏附,减低高糖诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1的表达,减少高糖诱导的Rho/RCOK通路激活,提示法舒地尔可能成为新的糖尿病大血管病变治疗药物。

Rho-ROCK信号通路功能及其活性调节

Rho-ROCK信号在细胞分化,细胞周期进展,增殖和凋亡中发挥着重要的作用。机体通过调节Rho-ROCK信号及其相关性因子可以诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为脂肪细胞,成骨细胞,成软骨细胞等。不同阶段ROCK信号通路的失调与心血管、代谢、神经退行性疾病、以及癌症的发生有关。主要阐述RhoROCK信号通路功能及调节Rho-ROCK活性的各种模式,为研究与之相关疾病提供思路。

基于Rho-ROCK信号转导通路调控肝纤维化研究进展

肝纤维化是各种慢性肝功能损伤保护性的代偿反应,是以细胞外基质生成增多和降解减少为主要表现、大量细胞外基质在肝内沉积为主要特征的病理过程。肝纤维化是慢性肝病向肝硬化和肝癌转变的必经过程。Rho-ROCK信号转导通路参与多种细胞生理活动,主要通过调节肝星状细胞的收缩和迁移参与肝纤维化的形成。肝星状细胞的活化在肝纤维化形成中具有重要作用,其活化后分泌的细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)是肝纤维化形成的物质基础。本文通过对Rho-ROCK信号转导通路和肝星状细胞的生物学特性以及Rho-ROCK信号转导通路对肝星状细胞的调控进行综述,以期为肝纤维化的防治提供新方向。

胆固醇结石病小鼠胆囊组织中Rho-ROCK信号、钙调信号相关分子的表达及意义

目的观察胆固醇结石病(胆石病)小鼠胆囊组织中Rho-ROCK信号和钙调信号相关分子的表达,探讨其在胆固醇结石形成过程中的作用。方法将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组和胆石组各20只,对照组给予正常饮食,胆石组给予高脂饮食诱导胆石病模型,连续8周。小鼠麻醉,剖腹观察胆囊的结石形成情况。胆总管插管,收集胆汁,采用荧光探针检测胆汁中的钙离子(Ca^2+)水平;眼球取血,采用HITACHI自动分析仪检测胆汁和血清总胆固醇和高密度胆固醇(HDL-C)含量,并计算非高密度脂蛋白胆固醇含量。小鼠脱颈椎处死,取胆囊组织,采用HE染色法观察胆囊组织的病理变化;采用RT-PCR法和Western blotting法检测胆囊组织中Rho-ROCK信号相关分子(RhoA、RhoB、ROCK)和钙调信号相关分子[肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、磷酸化的肌球蛋白轻链(p-MLC)、肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)]mRNA及蛋白表达。结果对照组胆囊无结石和胆泥形成,胆石组胆囊出现胆结石6只、胆泥5只,其余9只未造模成功被排除。与对照组相比,胆石组胆汁分泌率和胆汁中的Ca 2+水平下降,胆汁和血清总胆固醇、非高密度脂蛋白胆固醇升高(P均<0.05)。病理检查显示,胆石组胆囊组织出现炎症细胞浸润及胆囊壁增厚等炎症迹象。胆石组胆囊组织中RhoA、RhoB、ROCK、MLCK、p-MLC mRNA及蛋白表达较对照组下降,MLCP mRNA及蛋白表达较对照组升高(P均<0.05)。结论胆石病小鼠胆囊组织中Rho-ROCK信号和钙调信号相关分子的表达发生异常变化,Rho-ROCK和钙调信号相关分子可能参与了胆固醇结石的形成过程。

茯苓多糖调控Rho-ROCK信号通路对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响和机制研究

探讨茯苓多糖对心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MI/RI)大鼠心肌细胞凋亡的影响及可能机制。将SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、茯苓多糖低(100 mg·kg-1)剂量组、茯苓多糖高(200 mg·kg-1)剂量组和法舒地尔组(10 mg·kg-1),每组16只。除假手术组外,其他4组均通过结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注2 h以构建MI/RI模型。TTC染色检测心肌梗死面积;HE染色观察心肌组织形态学变化;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况;ELISA检测血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)和白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18水平以及心肌组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;Western blot检测大鼠心肌组织中B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、裂解半胱氨酸蛋白酶-3(cleavage cysteine protease-3,cleaved caspase-3)、Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene A,RhoA)、肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosin phosphatase target subunit 1,MYPT-1)及磷酸化MYPT-1(p-MYPT-1)、Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil forming kinase 1,ROCK1)表达水平。结果显示,模型组大鼠心肌组织局灶性坏死,心肌细胞肿胀,边界不清并伴有中性粒细胞浸润,茯苓多糖低、高剂量组和法舒地尔组大鼠上述病理变化有所减轻。与模型组比较,茯苓多糖低、高剂量组和法舒地尔组大鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率明显降低。与假手术组比较,模型组大鼠血清LDH、CK-MB、IL-1β及IL-18水平和心肌组织中MDA水平显著升高,Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK1及p-MYPT-1蛋白相对表达水平显著升高,心肌组织中SOD水平、Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低;与模型组比较,茯苓多糖给药组和法舒地尔组大鼠血清LDH、CK-MB、IL-1β及IL-18水平和心肌组织中MDA水平显著降低,Bax、cleaved caspase-3、RhoA、ROCK1及p-MYPT-1蛋白相对表达水平显著降低,心肌组织中SOD水平、Bcl-2蛋白相对表达水平显著升高。茯苓多糖对MI/RI大鼠心肌组织病理损伤、心肌细胞凋亡具有一定预防作用,这可能与抑制Rho-ROCK信号通路激活进而降低机体氧化和炎症反应有关。

夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织微环境Rho-ROCK Ⅱ通路相关因子的影响

目的:观察夹脊电针对脊髓损伤大鼠神经细胞轴突再生相关抑制因子重组人Ras同源物基因家族成员A(RhoA)、Rho蛋白激酶Ⅱ(ROCKⅡ)、肌球蛋白轻链(MLC)蛋白的影响,探讨夹脊电针治疗急性脊髓损伤(ASCI)的作用机制。方法:雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、夹脊电针组、抑制剂组,每组12只。采用脊髓打击法制备大鼠ASCI模型。夹脊电针组于模型制备成功后3h进行夹脊电针治疗,每日1次,每次30 min,连续治疗14d、28d;抑制剂组于造模成功后立即给予腹腔注射盐酸法舒地尔(10mg/kg),每日1次,连续治疗14d、28d。采用BBB评分法评估大鼠后肢运动功能变化,免疫组化法检测各组大鼠脊髓组织中RhoA、ROCKⅡ、MLC蛋白的表达情况。结果:BBB评分结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠运动功能评分显著降低(P<0.05);与模型组比较,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠运动功能评分均显著升高(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠肢体运动功能评分较造模后14d显著升高(P<0.05)。免疫组化结果显示:与假手术组比较,造模后14d、28d模型组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数增加(P<0.05);与模型组相比,造模后14d、28d夹脊电针组、抑制剂组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数显著降低(P<0.05);夹脊电针组、抑制剂组造模后28d大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ、MLC阳性细胞数较造模后14d显著降低(P<0.05)。结论:夹脊电针能够显著改善ASCI大鼠肢体运动功能,其作用机制可能与抑制大鼠脊髓损伤组织微环境Rho-ROCKⅡ信号通路RhoA、ROCKⅡ、MLC抑制因子表达有关。

肝星状细胞的激活和Rho-ROCK信号通路在纤维化大鼠小肝移植中的作用

目的在建立大鼠纤维化肝移植模型的基础上,检测肝星状细胞的激活,探讨Rho- ROCK信号通路及血管内皮生长因子(VEGF)的表达在小肝移植后供肝损伤中所起的作用。方法建立大鼠纤维化肝移植模型;分全肝移植组和小肝移植组。观察两组7 d生存率;移植后不同时间点取样本,应用α-SMA抗体进行免疫组织化学染色以测定肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell)的激活程度;Western blot检测Rho、ROCK I及VEGF的表达。结果成功建立大鼠纤维化肝移植模型; 全肝移植组和小肝移植组7 d生存率分别为58．3％(7／12)和8．3％(1／12,P<0．05);在同一组内不同时间点上,α-SMA的表达呈上升趋势;在各时间点上,小肝移植组α-SMA的表达均高于同一时间点全肝移植组,表明小肝移植组HSCs激活的程度总体上高于全肝移植组;小肝移植组Rho、ROCK I和VEGF的表达均高于同一时间点的全肝移植组。结论由于Rho—ROCK信号通路导致的肝星状细胞激活在大鼠纤维化肝移植中小体积供肝损伤有显著意义。

烟酰胺核糖对EAE小鼠的外周抗炎作用及其机制研究

目的探讨烟酰胺核糖(NR)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的外周抗炎作用及机制。方法采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35~55肽段(MOG35-55)诱导C57BL/6雌性小鼠制备EAE模型,随机分为EAE模型组和NR治疗组。EAE模型组每只小鼠按200μl/d剂量灌胃给予生理盐水,NR治疗组每只小鼠按500 mg/kg、200μl/d剂量灌胃给予NR,观察并记录各组小鼠临床评分和体质量。免疫后第28天处死小鼠,制备脾脏和脊髓冰冻切片,提取脊髓组织蛋白。HE染色检测外周炎性细胞浸润脊髓,免疫荧光染色检测小鼠脊髓CD4^(+)T细胞、CD68^(+)巨噬细胞数量,Western blot检测小鼠脊髓IFN-γ、IL-1β表达,免疫荧光染色检测小鼠脾脏ROCK-Ⅰ^(+)细胞、TLR4^(+)细胞、p-NF-κB^(+)细胞、TNF-α^(+)细胞、IL-1β^(+)细胞、IFN-γ^(+)细胞、IL-6^(+)细胞、IL-10^(+)细胞、IL-17^(+)细胞、i NOS^(+)细胞、Arg-1^(+)细胞数量。结果与EAE模型组相比,NR显著推迟EAE小鼠发病时间(P<0.05),降低临床评分(P<0.05或P<0.01),减轻体质量丢失,阻止外周炎性细胞浸润脊髓(P<0.01),减少脊髓CD4^(+)T细胞、CD68^(+)巨噬细胞数量(P<0.01),下调脊髓IFN-γ、IL-1β炎性因子表达(P<0.05),抑制小鼠脾脏ROCK-Ⅰ、TLR4、p-NF-κB表达(P<0.01),减少脾脏IFN-γ、i NOS、IL-6等促炎因子分泌(P<0.05或P<0.01),促进脾脏抗炎因子Arg-1、IL-10分泌(P<0.05或P<0.01)。结论NR能够有效缓解EAE小鼠临床症状,显著减轻外周和中枢神经系统炎症反应,其机制可能与抑制EAE小鼠脾脏Rho/ROCK信号通路和TLR4/NF-κB信号通路有关。

Effect of Rho-ROCK signaling pathway on pulmonary fibrosis

Idiopathic pulmonary fibrosis（IPF） is characterized by progressive lung scarring, reduced median survival, poor prognosis and limited therapeutic options, leading to great need for new pharmacologic therapies. In recent years, researchers have found that Rho-ROCK signaling pathway may be a new drug target in the prevention of IPF. This article reviewed the role of Rho-ROCK pathway in pulmonary fibrosis and the application of ROCK inhibitors in experimental models of IPF. Multiple lines of evidence therefore indicated that ROCK inhibition has great potential to be a powerful therapeutic tool in the prevention and treatment of IPF in clinic.

桂楼复方对子宫腺肌病异位内膜细胞迁移和侵袭的影响研究

背景子宫腺肌病(AM)是妇科常见的疑难病,但其具体机制尚未明确。中医药治疗AM有一定优势,前期研究显示,桂楼复方宫内缓释系统可明显降低AM模型大鼠子宫内膜细胞增殖、侵袭能力。目的探讨桂楼复方对子宫腺肌病异位内膜细胞(AMDC)迁移、侵袭的影响,并研究其对Rho/ROCK信号通路的影响。方法本研究于2021年10月—2023年4月在山东中医药大学附属医院实验中心完成。使用CCK-8法检测AMDC细胞活力并筛选最佳药物浓度。设置空白组,使用桂楼复方(50、100 mg/L)处理AMDC,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,免疫印迹法Western Blotting)/实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测RhoA、RhoB、RhoC、ROCK1、ROCK2在蛋白和mRNA水平的表达情况。Rescue实验中使用激动剂U-46619(1μmol/L)和桂楼复方(100 mg/L)处理AMDC,Western Blotting法检测RhoA、RhoB、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白表达改变情况。结果与空白组比较,100 mg/L桂楼复方干预后AMDC细胞存活率未明显降低,差异无统计学意义(P>0.05),是不影响细胞活性的最佳药物浓度。选取50、100 mg/L桂楼复方进行后续实验。与空白组比较,桂楼复方50 mg/L、100 mg/L组AMDC迁移、侵袭能力受到抑制(P<0.001),RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白及mRNA表达水平下调(P<0.001),U-466191μmol/L组RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白表达上调(P<0.001)。与U-466191μmol/L组比较,U-466191μmol/L联合桂楼复方100 mg/L组RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白表达下调(P<0.001)。空白组与桂楼复方50 mg/L、100 mg/L组RhoB的蛋白及mRNA表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论桂楼复方可有效抑制AMDC的迁移、侵袭能力,不影响细胞活性的最佳药物浓度为100 mg/L,桂楼复方可下调RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2的蛋白及mRNA表达水平,并可逆转U-46619对RhoA、RhoC、ROCK1、ROCK2蛋白表达水平的上调作用,从而抑制AM病局部异位病灶的持续进展,其作用可能与调控Rho/ROCK通路密切相关。

莪术醇对肝星状细胞Rho-ROCK信号通路作用的实验研究

目的:研究莪术醇对肝星状细胞Rho-ROCK信号通路的作用,以此来分析莪术醇抗肝纤维化的作用机制。方法:用莪术醇孵育HSC-T6细胞48 h后用MTT法检测细胞增殖率,用免疫印迹和RT-PCR检测Rho-ROCK信号通路上关键分子RhoA和ROCK2的表达和含量。结果:RT-PCR检测发现莪术醇高、中、低浓度对Rho-ROCK信号通路中的关键分子RhoA和ROCK2mRNA的表达较模型组有抑制作用,而且这种抑制作用有明显的剂量依赖性,差异有显著性(P<0.05);WB检测发现莪术醇高、中、低浓度对Rho-ROCK信号通路中的关键分子RhoA和ROCK2的表达较模型组有抑制作用,而且这种抑制作用有明显的剂量依赖性,差异有显著性(P<0.05)。结论:莪术醇可以抑制Rho-ROCK信号通路的活动,达到抗肝纤维化的效果。

艾灸联合保真汤加减治疗糖尿病肾病的疗效观察及对CT灌注参数、Rho/ROCK信号通路蛋白的影响

目的 观察艾灸联合保真汤加减治疗糖尿病肾病气阴两虚证的临床疗效及对CT灌注参数、Rho/ROCK信号通路蛋白的影响。方法 将146例糖尿病肾病气阴两虚证患者随机分为观察组(74例)和对照组(72例)。在对症治疗的基础上,对照组给予厄贝沙坦片,观察组给予艾灸联合保真汤加减。观察两组中医主症积分、CT灌注参数[血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, SCr)、尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER)和24 h尿蛋白定量(24-hour urinary protein quantification, 24 h Upro)]、肾血流指标[舒张末期血流速度(end-diastolic velocity, EDV)、肾段动脉的收缩期峰值流速(peak-systolic velocity, PSV)、搏动指数(pulsatility index, PI)和阻力指数(resistive index, RI)]、血清炎性因子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)和C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)]水平及Rho/ROCK信号通路[Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member A, RhoA)、Rho关联含卷曲螺旋蛋白激酶Ⅰ(Rho-associated coiled-coil containing protein kinaseⅠ, ROCKI)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和钙黏附蛋白-E(E-cadherin, E-Cad)]蛋白水平,并比较两组临床疗效及不良反应。结果 观察组总有效率为97.3%(72/74),明显高于对照组的81.9%(59/72)(P<0.05)。观察组治疗后中医主症积分低于治疗前和对照组(P<0.05)。两组治疗后CT灌注参数降低(P<0.05),且观察组低于对照组(P<0.05)。观察组治疗后PSV、EDV较治疗前和对照组加快(P<0.05),RI、PI较治疗前和对照组降低(P<0.05)。观察组治疗后血清炎性因子水平较治疗前和对照组降低(P<0.05)。观察组治疗后Rho A、ROCKI、α-SMA蛋白水平较治疗前和对照组降低(P<0.05),E-Cad蛋白水平较治疗前和对照组升高(P<0.05)。观察组不良反应发生率为1.4%(1/74),低于对照组的19.4%(14/72)(P<0.05)。结论 在对症治疗的基础上,艾灸联合保真汤加减可明显提高糖尿病肾病气阴两虚证患者的治疗效果,其机制可能与改善CT灌注参数,调节血清Rho/ROCK信号通路蛋白相关。

黄芩苷通过ROS依赖性调节RhoA/ROCK通路保护氯化钴诱导心肌细胞损伤的实验研究

目的:本研究旨在探讨黄芩苷(Baicalin)对氯化钴(CoCl_(2))诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的作用机制。方法:采用CoCl_(2)建立心肌细胞缺氧损伤模型,并分别加入不同浓度的黄芩苷培养。将正常氧培养设置为对照组,CoCl_(2)培养H9c2心肌细胞设置为CoCl_(2)组;Baicalin、Y27632(Rho激酶抑制剂)预处理的H9c2缺氧心肌细胞设置为CoCl_(2)+Baicalin组、CoCl_(2)+Y27632组、CoCl_(2)+Baicalin+Y27632组。通过细胞毒性检测试剂盒(CCK8)检测细胞活性;荧光探针测定细胞中活性氧(ROS)的表达;WST-8检测心肌细胞超氧化歧化酶(SOD)活力;TBA法测定丙二醇(MDA)浓度;同时采用WesternBlot方法分析RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达情况。结果:处理H9c2细胞24 h后,1 000μmol/L的CoCl_(2)和75μmol/L黄芩苷对治疗心肌细胞缺氧损伤具有较好的细胞活力。CoCl_(2)组细胞活性明显低于对照组,加入黄芩苷后可显著提高细胞活性(P<0.05);与对照组相比,CoCl_(2)组心肌细胞可上调ROS、MDA表达,下调SOD活力,升高RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,加入Baicalin后可逆转上诉蛋白的表达水平;与CoCl_(2)组相比,CoCl_(2)+Baicalin可抑制ROS、MDA的表达,上调SOD含量,下调RhoA、ROCK1、ROCK2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平,而加入Y27632(Rho激酶抑制剂)后则可显著增强Baicalin带来的保护作用。结论:Baicalin可减轻CoCl_(2)诱导H9c2心肌细胞缺氧损伤的炎症、氧化应激反应,其机制与抑制ROS依赖性RhoA/ROCK通路有关。

Rho A-Rock 1信号通路对传染性脾肾坏死病毒感染的调控及作用

【目的】探究传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)复制增殖与Rho A-Rock 1通路的关系。【方法】采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ISKNV感染CPB细胞12,24,48,72和96 h后病毒DNA拷贝数的变化;同时采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹方法检测病毒感染CPB细胞12,24,48和72 h后Rho A与Rock 1转录及蛋白表达水平的变化;通过Rho A抑制剂(CCG-1423和Rhosin)、Rock 1抑制剂(Thiazovivin和Y-27632)及siRNA抑制Rho A-Rock 1通路,研究Rho A-Rock 1通路抑制对ISKNV复制增殖的影响。【结果】ISKNV感染12~48 h,病毒的DNA拷贝数无显著变化,感染72 h病毒DNA拷贝数显著上升,感染96 h病毒的拷贝数上升变缓,说明ISKNV感染72 h时病毒正处于复制增殖的高峰期。RT-qPCR及蛋白免疫印迹结果表明,ISKNV感染72 h时,Rho A和Rock 1 mRNA转录水平和蛋白水平均显著上调。Rho A抑制剂Rhosin和CCG-1423及Rock 1抑制剂Y-27632和Thiazovivin均可使ISKNV基因组拷贝数和病变的CPB细胞数显著下调;利用siRNA敲降Rho A和Rock 1时,ISKNV的基因组拷贝数也显著下调。【结论】Rho A-Rock 1信号通路可正调控ISKNV的感染,抑制Rho A-Rock 1通路可显著抑制ISKNV复制增殖。

抑制Rho/ROCK通路对气道平滑肌细胞增殖与迁移的影响及相关机制

目的研究抑制Ras同源基因(Ras homolog gene,Rho)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rhoassociated coiled-coil forming protein kinase,ROCK)通路对心肌素(myocardin,MYOCD)参与的气道平滑肌细胞增殖与迁移的影响及分子机制。方法体外构建腺病毒载体Ad-ZsGreen-shRNA-hROCK1感染人气道平滑肌细胞,将细胞随机分为4组:ROCK1基因沉默对照(shNC)组、shNC+花生四烯酸(arachidonic acid,AA;Rho/ROCK通路激活剂)组、ROCK1基因沉默(shROCK1)组、shROCK1+AA组(各组n=3)。采用实时荧光定量聚合酶链反应法、Western blot法检测ROCK1、MYOCD mRNA和蛋白表达水平,ELISA法检测球状肌动蛋白和丝状肌动蛋白水平,免疫荧光染色法及细胞划痕实验检测细胞增殖及迁移情况。结果与shNC+AA组相比,shROCK1+AA组ROCK1、MYOCD mRNA和蛋白表达水平降低,球状肌动蛋白、丝状肌动蛋白表达降低,细胞增殖、细胞迁移能力降低(P<0.05)。结论抑制Rho/ROCK通路致气道平滑肌细胞增殖及迁移能力受抑,其机制可能与MYOCD的下调有关.

地诺孕素配合腹腔镜治疗子宫内膜异位症的效果及对Rho/ROCK信号通路的影响

目的探讨地诺孕素配合腹腔镜治疗子宫内膜异位症(EMT)的效果及对Rho/Rho激酶(ROCK)信号通路的影响。方法选取2020年6月至2022年6月湖南妇女儿童医院救治的80例EMT患者,按随机数字表法分为对照组(40例)和观察组(40例)。对照组采用单纯腹腔镜+醋酸亮丙瑞林微球治疗,观察组采用地诺孕素配合腹腔镜+醋酸亮丙瑞林微球治疗。治疗6个月后对比两组的临床疗效及不良反应发生情况;比较治疗前及治疗6个月后两组性交痛、月经期间疼痛、非经期下腹疼痛的视觉模拟评分法(VAS),卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)水平,以及Rho/ROCK信号通路相关分子(RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ)水平。结果观察组治疗总有效率为95.00%,高于对照组的85.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前,两组性交痛、月经期间疼痛、非经期下腹疼痛的VAS评分比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗6个月后,两组性交痛、月经期间疼痛、非经期下腹疼痛的VAS评分均较治疗前降低(P<0.05),且观察组性交痛、月经期间疼痛、非经期下腹疼痛的VAS评分均低于对照组(P<0.05)。治疗前,两组FSH、LH、E2水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗6个月后,两组FSH、LH、E2水平均较治疗前降低(P<0.05),且观察组FSH、LH、E2水平均低于对照组(P<0.05)。治疗前,两组RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗6个月后,两组RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ水平均较治疗前降低(P<0.05),且观察组RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ水平均低于对照组(P<0.05)。治疗6个月后,观察组的不良反应总发生率为5.00%,明显低于对照组的15.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论地诺孕素配合腹腔镜治疗EMT有助于提高临床疗效,改善患者疼痛评分,降低患者雌激素水平,还可抑制Rho/ROCK信号通路相关因子的表达,降低不良反应发生率。

大鼠脊髓损伤及N2a细胞株缺氧后Rho-ROCK通路的变化

目的观察脊髓损伤（SCI）后RhoA活性变化和体外模拟脊髓缺血再灌注诱导的神经元损伤中Rho激酶（ROCK）下游底物肌动蛋白（F-actin）细胞骨架的重组，探讨ROCK通路对于SCI后轴突萎陷的作用机制。方法成年sD大鼠Allen’s制模，Westernblot检测RhoA蛋白表达，GSTPulldownassay RhoA活性变化；培养N2a细胞，置于含90％N2的37℃培养箱中模拟脊髓继发损伤中缺血缺氧和再灌注过程，MTT检测细胞活力，并用FITC标记的鬼笔毒环肽染色神经元F-actin，免疫荧光观察其重组。结果SCI后RhoA总蛋白表达无明显变化（P〉0．05），但活性逐步增高（P〈0．05）；正常N2a细胞F-actin主要分布于细胞周边，应力纤维少，缺氧后胞质周边肌动蛋白丝带模糊，轴突回缩，胞质内应力纤维增多；而加入Y-27632的N2a缺氧后无此过程，且缺氧后再加入Y-27632亦可明显逆转此过程；MTT显示Y-27632能显著提高N2a缺氧和再灌注24h后的存活率（P〈0．05），且保护作用在一定范围内和浓度成正比。结论SCI后神经元轴突中RhoA的活性增高并过度激活ROCK，影响轴突内F—actin细胞骨架的重组，从而导致生长锥萎陷和轴突回缩；对ROCK进行抑制可以预防轴突塌陷和神经元死亡，促进轴突再生。