比利时杜鹃花类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因克隆及功能分析

【目的】类黄酮3’-羟化酶(flavanone 3’-hydroxylase,F3’H)是植物花青素合成过程中的关键酶,探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort)F3’H基因的功能及表达特性。【方法】以比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣及盛花期的根、茎、叶为实验材料,从比利时杜鹃花转录本数据库中筛选类黄酮生物合成通路关键酶类黄酮3’-羟化酶基因序列信息并进行生物信息学分析,利用反转录(RT-PCR)技术克隆RhF3’H基因;利用紫外分光光度计测定了比利时杜鹃花花瓣不同时期的花青素含量,利用RT-qPCR技术对不同发育时期花瓣和成熟期的不同组织进行RhF3’H基因表达量分析;采用Gateway技术构建过表达载体35S:RhF3’H-GFP重组载体进行亚细胞定位验证;构建p1302-RhF3’H过表达载体对比利时杜鹃花花瓣进行侵染。【结果】成功获得比利时杜鹃花RhF3’H基因长度为1557 bp,编码518个氨基酸,具有保守的F3’H结构域,属于P450超家族;系统进化树分析显示,比利时杜鹃花RhF3’H与龙眼和荔枝F3’H蛋白亲缘关系最近;RT-qPCR结果显示,RhF3’H在比利时杜鹃花不同花瓣时期和根、茎、叶组织中均有表达,在不同花瓣发育时期中,盛开期和衰败期中RhF3’H基因的表达量较高,与花青素含量结果相一致;亚细胞定位分析显示,RhF3’H主要存在于细胞膜上;成功构建P1302-RhF3’H瞬时过表达载体,相较于CK和p1302,p1302-RhF3’H在杜鹃花花瓣中显著高表达,其花青素含量也显著增加。【结论】RhF3’H基因在花瓣细胞膜中表达,表达模式与花青素积累趋势一致;过表达RhF3’H基因促进了花青素的合成。

比利时杜鹃花 RhDFR 基因克隆及分析

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是植物花青素合成过程中的关键酶,能够催化二氢黄酮醇生成无色花青素。该试验以红色和白色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同器官和不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhDFR基因,利用植物酶联免疫试剂盒(ELISA)测定不同发育时期的花瓣RhDFR酶活性,利用qRT-PCR技术定量分析不同器官和不同发育时期的花瓣RhDFR基因,构建pET-28a-RhDFR原核表达载体对RhDFR蛋白进行制备和纯化,为进一步探究杜鹃花DFR基因功能以及花色的分子机理奠定基础。结果表明:(1)成功获得比利时杜鹃花RhDFR基因全长1253 bp,其开放阅读框1035 bp,编码344个氨基酸,含有1个NADPH结合保守基序和1个底物结合区域,具有高度保守性;系统进化分析显示,比利时杜鹃花RhDFR蛋白与越橘(Vaccinium corymbosum)DFR蛋白亲缘关系最近。(2)ELISA试剂盒分析显示,比利时杜鹃花不同发育时期的花瓣DFR酶活性呈先上升后下降的趋势,并于红花初开期和白花盛开期的DFR酶活性最高。(3)qRT-PCR分析显示,不同器官中RhDFR基因的表达量为花瓣最高,雄蕊最低;不同发育时期的花瓣中,红色花的RhDFR基因表达量高于白色花。(4)成功构建原核表达载体pET-28a-RhDFR并诱导表达出大小约为38 kD的蛋白,与理论值相近。研究认为,杜鹃花中DFR酶活性的功能多样化,DFR基因与比利时杜鹃花花瓣的颜色有关。

比利时杜鹃花花青素合成酶基因(RhANS)克隆及其功能分析

花青素合成酶(ANS)是植物花青素合成途径中的关键酶。为探究比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)ANS基因的功能及表达特性,本研究以比利时杜鹃花不同发育时期花瓣及盛花期的根、茎、叶为试验材料,利用反转录(RT-PCR)和RACE技术克隆RhANS基因cDNA序列;利用超高效液相色谱质谱(Waters UPLC-Qtof)技术分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣中花青素含量;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析比利时杜鹃花不同发育阶段花瓣和不同器官中ANS基因相对表达量;将RhANS基因重组到原核表达载体(pET-28a)上,并在大肠杆菌(BL21)中进行表达纯化出目的蛋白,并利用高效液相色谱(HPLC)检测目的蛋白RhANS的酶活性。结果表明,从比利时杜鹃花克隆得到RhANS基因cDNA全长序列1350 bp,开放阅读框(ORF)序列1074 bp,编码357个氨基酸,含有2-酮戊二酸双加氧酶家族基因结构域2OG-FeⅡ-Oxy;比利时杜鹃花花青素含量随着花的开放呈逐渐上升的变化趋势;RhANS基因表达量在比利时杜鹃花4个花期的花瓣和不同器官(根、茎和叶)中均表达。不同花发育时期RhANS表达量与花青素含量呈上升趋势;通过大肠杆菌原核表达载体诱导表达出大小约为40 kDa的蛋白,与理论值相近。高效液相色谱仪(HPLC)检测表明,目的蛋白具有ANS酶活性。本研究为杜鹃花中花青素生物合成的分子调控机理提供了理论依据。

3种园林植物耐寒性的研究

[目的]测定西鹃、小蜡、南洋杉3种植物的半致死温度,为各地园林应用提供理论参考。[方法]电导法配合Logistic方程,通过DPS9.5统计软件进行非线性回归分析确定半致死温度;采用茚三酮比色法,测定叶片游离脯氨酸含量。[结果]用电导法配合Logistic方程计算小蜡、西鹃、南洋杉半致死温度,分别为-7.12、-8.61、-6.03℃。[结论]自然生长的成年小蜡、西鹃、南洋杉在不同休眠时期耐寒能力有一定差异。

比利时杜鹃研究进展

从生物学特性、繁殖、栽培、育种等方面归纳总结了近20年比利时杜鹃研究的 成果,并通过对相关文献的分析,就目前国内该领域研究的不足,及今后发展的主要方向与 重点进行了讨论。

比利时杜鹃生物量调查

对比利时杜鹃的含水量及生物量进行了研究,结果显示叶的含水量最大,茎、根次之,但全株含水量变化不大,约占60%;根部的含水量及生物量变化最大;R/S比值逐年增大,但还是较小。此外,本文还采用相关分析及建立生物量一元线形回归、多元线性回归、非线性回归等回归方程,确定预测生物量的最佳回归模型。

比利时杜鹃的生物学特性初探

本文对盆栽比利时杜鹃(Rhododendron hybridumHot.)的生物学特性及生长量进行了初步调查研究,对主要形态因子进行相关分析并建立一元线形回归、多元线性回归等回归模型。

红比利时杜鹃愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系构建及植株再生

为建立红比利时杜鹃花愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,以嫩叶为材料,探讨了愈伤组织诱导与增殖的条件,构建并评价了愈伤悬浮颗粒瞬时转化体系,同时诱导愈伤颗粒出芽、生根,并获得组培小苗。结果表明,在2.41 g·L^(-1)木本植物基本培养基(WPM)+20 g·L^(-1)蔗糖+10 g·L^(-1)麦芽糖+7.0 g·L^(-1)琼脂+0.050 mg·L^(-1)植物组培抗菌剂(PPM)为基本培养基的条件下,嫩叶愈伤组织诱导的生长调节剂最优方案为:0.3 mg·L^(-1)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.3 mg·L^(-1)噻重氮苯基脲(TDZ),此时愈化率可达97.78%;愈伤组织继代增殖的生长调节剂方案为:0.61 mg·L^(-1)2,4-二氧苯氧乙酸(2,4-D)+0.65 mg·L^(-1)6-苄基腺嘌呤(6-BA)+1.37 mg·L^(-1) TDZ,此时增殖率可达167%。将继代5次后呈疏松状的愈伤颗粒接种于液体继代培养基中,大约4~12 d后愈伤颗粒进入指数生长阶段,增殖率为45%。含有GUS基因的pRI 101-AN与含有GFP基因的pCAMBIA1301-GFP分别在农杆菌GV3101介导下转化处于指数生长期的愈伤悬浮颗粒,OD_(600)为0.6的农杆菌侵染液侵染15 min后,愈伤颗粒的GUS染色效率为26.28%,愈伤颗粒的GFP荧光表达效果明显。另外,以2.41 g·L^(-1) WPM+7 g·L^(-1)琼脂+20 g·L^(-1)蔗糖为基本培养基,添加2.0 mg·L^(-1)TDZ+0.5 mg·L^(-1)2,4-D时,可诱导愈伤组织不定芽;以1/2 Read为基本培养基,添加0.5 mg·L^(-1) IBA+1 g·L^(-1)活性炭可诱导出芽的愈伤颗粒生根。本研究结果为进一步开展红比利时杜鹃花稳定遗传转化研究和转基因植株培育奠定了基础。

比利时杜鹃花黄烷酮3-羟化酶基因克隆及功能分析

黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)是植物花青素(anthocyanin)合成过程中的关键酶。本研究以红色比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)不同发育时期的花瓣为实验材料,利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术对比利时杜鹃花黄烷酮3-羟化酶(Rhododendron hybridum Hort.flavanone 3-hydroxylase,RhF3H)基因进行克隆,并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR技术对不同发育时期花瓣RhF3H基因表达量进行分析;构建pET-28a-RhF3H原核表达载体对RhF3H蛋白进行制备和纯化;构建pCAMBIA1302-RhF3H过表达载体,通过农杆菌介导法进行拟南芥遗传转化研究。结果表明,比利时杜鹃花RhF3H基因全长为1245 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1092 bp,编码363个氨基酸,含有Fe2+结合基序和2-酮戊二酸结合基序的双加氧酶超家族。系统进化分析表明,比利时杜鹃花RhF3H蛋白与越橘F3H蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析表明,在不同发育时期花瓣中,红色比利时杜鹃花RhF3H基因的表达水平呈先上升后下降的趋势,在初开期表达量最高;原核表达结果表明,构建原核表达载体pET-28a-RhF3H诱导蛋白大小约为40 kDa,与理论值相近;成功获得转基因RhF3H拟南芥植株,PCR鉴定和β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)染色证明RhF3H基因整合到拟南芥植株基因组中。qRT-PCR、总黄酮和花青素含量分析显示,相对于野生型,RhF3H在转基因拟南芥植株中显著高表达,其总黄酮和花青素含量也显著增加。本研究为探究杜鹃花RhF3H基因功能提供一定的理论基础,对杜鹃花花色的分子机理有重要的研究价值。