青杄PwRhomboid基因表达特性及其抗旱作用

通过对青杄转录组测序分析,筛选出干旱响应基因PwRhomboid,分析该基因在耐旱方面的功能特性,为揭示青杄的耐旱机理提供理论基础。采用生物信息学对PwRhomboid的氨基酸序列和同源基因进行比对;利用RT-qPCR技术分析PwRhomboid对不同非生物胁迫和激素的响应情况;通过瞬时转化烟草叶片检测PwRhomboid蛋白的亚细胞定位;获得拟南芥和马铃薯的PwRhomboid转基因株系并进行干旱表型验证。研究结果显示,PwRhomboid的氨基酸序列在N端与其同源物种的氨基酸序列具有较大差异,在C端相似度较高,保守性较好;其蛋白主要定位于细胞膜。PwRhomboid的表达量经干旱、低温和脱落酸诱导后发生有显著变化,在成熟叶中表达量最高,其能够提高转基因拟南芥和马铃薯的耐旱性。经干旱处理后,与对照组拟南芥野生型和pCM1205株系相比,PwRhomboid过表达株系PwRhomboid-L1和PwRhomboid-L2的存活率更高,叶绿素荧光最大光化学效率和实际光化学效率更高;在经聚乙二醇模拟干旱处理后,与野生型相比,过表达株系PwRhomboid-L3、PwRhomboid-L4的马铃薯苗高更高。结果表明PwRhomboid的表达量会受到干旱等逆境和激素的影响,过表达PwRhomboid能够提高拟南芥和马铃薯的耐旱性。

柔嫩艾美耳球虫rhomboid抗原基因在卡介苗中的克隆与表达

以含柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因的重组质粒为模板,应用PCR方法扩增该基因完整开放阅读框,克隆至pMD18-T载体中。分别用限制性内切酶PstⅠ/ClaⅠ和PvuⅡ/ClaⅠ进行双酶切,将rhomboid目的基因克隆到大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pRho-261和pRho-361。将重组质粒电穿孔转化卡介苗,经热诱导后对其表达产物进行SDS-PAGE和western blot分析。结果表明成功构建了两个重组质粒,其表达产物与柔嫩艾美耳球虫阳性血清具有免疫反应性,为重组卡介苗在鸡球虫病防治方面的研究奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫F2杂交株Rhomboid基因在大肠杆菌中的表达

根据ET-Rhomboid基因开放阅读框,插入有利于表达的酶切位点设计引物,以虫体DNA为模板扩增并克隆了ET-Rhomboid基因,并将该基因与PET-28a(+)质粒载体连接,构建成了原核表达载体PET-ET-Rhom-boid。将构建好的表达质粒转入大肠杆菌DE3,经IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE检测表达产物,用蛋白印迹(Western blotting)检测其反应原性。结果表明:含重组质粒的工程菌有明显的表达产物为31 kD的融合蛋白,与推测的融合蛋白的分子量吻合,蛋白印迹检测具有反应原性。

斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因抗原优势区的筛选与鉴定

为了筛选并鉴定斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因抗原优势区,试验采用预测斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因跨膜结构域,PCR扩增4段目的片段,构建表达载体,并通过SDS-PAGE和Westernblot技术分析目的蛋白。结果表明:成功克隆出4段斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因,片段大小分别为102 bp、75 bp、93 bp、99 bp,重组原核表达质粒p ET-32a-Rho1~4构建成功;经SDS-PAGE和Western-blot分析,构建的4段重组质粒都得到了表达且与理论值相符,且重组蛋白中p ET-32aRho4可与兔斯氏艾美耳球虫阳性血清发生特异性反应。

柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究

以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4+、CD8+含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.

弓形虫Rhomboid-IL-2基因重组卡介苗的构建及其对犬的免疫效果

目的构建弓形虫Rhomboid以及犬白介素2基因重组卡介苗,并观察其对免疫犬的免疫效果。方法将鉴定正确的弓形虫Rhombiod基因和犬IL-2基因一起克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体和整合表达载体中,构建重组质粒pMV261(361)-IL2-Rho。将重组质粒转入卡介苗中,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot鉴定。分别用重组卡介苗pMV261(361)-IL2-Rho和pMV261(361)-Rho经皮下免疫犬,检测免疫犬体液及细胞免疫水平变化并观察其存活时间。结果成功构建pMV261(361)-IL2-Rho重组质粒,弓形虫Rhomboid基因在重组卡介苗中稳定表达46ku的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被弓形虫感染鼠血清识别。动物实验表明,rBCGpMV261(361)-IL2-Rho能诱导产生较强的体液免疫和Th1型细胞免疫应答反应,rBCGpMV361-IL2-Rho免疫组感染弓形虫后的存活时间组为(14.40±4.50)d,rBCGpMV261-IL2-Rho免疫组感染弓形虫后的存活时间组为(13.00±4.75)d,较BCG对照组存活时间(8.20±5.45)d有所延长。结论 rBCGpMV261(361)-IL2-Rho蛋白具有免疫原性。该重组卡介苗对犬弓形虫感染有一定保护效果。

斯氏艾美耳球虫兰州株Rhomboid基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai,E.stiedai)兰州株Rhomboid基因。方法通过分析基因保守区设计引物,采用RT-PCR方法与3′RACE技术相结合,扩增获得兔斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因cDNA全序列,并对其进行序列分析;将获得的Rhomboid基因克隆至原核表达载体pET-28a中,转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果 Rhomboid基因开放阅读框全长774 bp,编码257个氨基酸残基,预测蛋白质相对分子质量和等电点分别为28 120和8.64,与鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tellan)Rhomboid蛋白氨基酸序列的同源性为84.44%;构建的重组原核表达质粒pET-Rhomboid经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,并可与兔抗E.stiedai阳性血清发生特异性反应。结论成功克隆并表达了Rhomboid基因,为其生物学功能及以其作为斯氏艾美耳球虫疫苗候选基因的研究奠定了基础。

贝氏隐孢子虫Rhomboid基因的克隆与生物信息学分析

将Gen Bank中发表的C.parvum、C.hominis和C.muris的菱形体蛋白(Rhomboid,ROM)基因序列进行比对分析,设计合成该基因保守片段的1对特异性引物,以贝氏隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增出CbROM基因保守片段,采用染色体步移技术获得基因片段3'端和5'端核苷酸序列,并对所得序列进行测序、拼接与生物信息学分析。结果显示,CbROM基因ORF长度为1 422 bp,编码473个氨基酸,蛋白质理论相对分子质量为52 700,等电点为8.65,是疏水性蛋白质,含有7个串连的跨膜螺旋区,无信号肽;该基因含有典型的菱形体蛋白相关保守结构域,属于菱形体蛋白酶家族;功能位点分析结果显示,CbROM蛋白序列包含6个N-糖基化位点,2个c AMP、c GMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,8个蛋白激酶C磷酸化位点,7个酪蛋白激酶II磷酸化位点和10个N-豆蔻酰化位点;二级结构中包含α-螺旋38.27%,β-折叠16.7%和无规则卷曲45.03%。本试验获得的贝氏隐孢子虫的Rhomboid基因序列,为该基因功能的进一步研究及其基因工程疫苗的研制奠定基础。

微小隐孢子虫与安氏隐孢子虫Rhomboid基因部分序列的克隆和分析

目的获得我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因(CPRho和CARho)部分序列并确定与国外分离株相应序列的同源性。方法应用RT-PCR技术扩增微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因片段,然后将其克隆到pMD18-T载体中,测得序列应用DNAMAN软件进行序列分析。结果经RT-PCR扩增出微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,大小均为723 bp。经DNA MAN软件分析,表明我国微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid核苷酸序列同源性为99.6%,氨基酸同源性为99.2%。二者与GenBank公布的相应序列核苷酸同源性分别为99.9%和99.7%,而氨基酸同源性均为99.6%。结论获得了微小隐孢子虫长春株与安氏隐孢子虫长春株Rhomboid基因部分序列,为继续研究该基因的侵入功能等奠定了基础。

猪弓形虫重组卡介苗的构建及其免疫保护性

目的构建弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因的重组卡介苗(BCG),并分析其免疫保护效果。方法应用RT-PCR技术分别扩增弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因,克隆至p MD18-T载体中,双酶切鉴定及测序正确后,将弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因串联后分别连接至穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,电转化BCG,制备重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho。分别经颈部肌肉注射免疫猪,共3次,每次间隔2周,免疫剂量均为108 CFU/只,采用ELISA法检测免疫前后猪体内抗体(IgG)滴度、Th1型及Th2型细胞因子的变化情况;第3次免疫后2周通过腹腔注射的方式接种弓形虫China I株速殖子1×108个/只进行攻虫试验,观察重组BCG对猪的免疫保护效果。结果成功构建了重组BCG p MV261-IL-2-Rho和p MV361-IL-2-Rho。重组BCG免疫猪后,随着免疫次数的增加,血清中抗体滴度也逐渐升高,且与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。3次免疫后,pMV261-IL-2-Rho组血清Th1型细胞因子IL-2、IFNγ和IL-12的表达水平均明显提高,与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而pMV361-IL-2-Rho组血清IL-2、IFNγ和IL-12的水平虽略有升高,但与PBS对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);各组在免疫过程中Th2型细胞因子IL-4水平均未发生明显变化。攻虫后各组猪出现精神沉郁,食欲下降,体温升高等症状,耐过发病期后的猪,食欲逐渐恢复,体温渐趋正常,各种症状减轻,且各组猪在攻虫后20 d均无死亡。结论构建的基因重组BCG pMV261-IL-2-Rho对猪弓形虫感染具有一定的免疫保护作用。