刚地弓形虫重组蛋白SporoSAG、ROP5表达及免疫原性研究

弓形虫子孢子表面抗原(SporoSAG)和棒状体蛋白5(ROP5)是不同阶段虫体表面的特异性抗原,与弓形虫分化及入侵宿主细胞密切相关。本研究表达并纯化重组蛋白rSporoSAG与rROP5,将重组蛋白通过单独、联合等不同方式分别免疫Balb/c小鼠,检测小鼠体液和细胞免疫水平。结果显示rSporoSAG和rROP5成功表达,大小分别约为49.4和38.2 kDa。小鼠免疫实验中,rSporoSAG组、rROP5组、rSporoSAG+rROP5组、初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5组总IgG、IgG1、IgG2a水平与对照组相比显著升高(P<0.05),其中,初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5组的总IgG和IgG2a水平最高。细胞因子检测显示初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5组IL-2水平与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),其他组IL-2水平与对照组相比无显著差异(P>0.05)。各实验组IL-4、IFN-γ水平与对照组相比无显著差异(P>0.05)。淋巴细胞增殖实验结果显示各实验组与对照组间均无显著差异(P>0.05)。结果表明,本实验成功表达rSporoSAG、rROP5。rSporoSAG、rROP5单独或联合等免疫Balb/c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫,但不能有效激活细胞免疫应答,仅初次免疫rSporoSAG二次免疫rROP5组IL-2水平与对照组具有显著性差异,提示先免疫rSporoSAG再免疫rROP5蛋白的免疫策略与其他免疫策略相比是一种更有效的方法,可用于预防弓形虫卵囊感染的研究。

重组弓形虫棒状体蛋白5诱导小鼠的免疫应答及其抗弓形虫感染的保护作用

为探讨重组弓形虫棒状体蛋白5诱导的免疫应答及其免疫保护效应，本研究克隆表达了弓形虫棒状体蛋白5，并分析其诱导的细胞免疫、体液免疫应答和抗弓形虫感染的保护作用。采用PCR方法从刚地弓形虫cDNA中扩增出ROP5基因片段，将该基因片段克隆至pET-28a原核表达载体表达，用重组ROP5蛋白免疫BALB／c小鼠，ELISA检测免疫后小鼠抗体和细胞因子的变化。以强毒型RH株弓形虫攻击感染免疫小鼠，统计小鼠不同时间存活率，评价重组蛋白产生的免疫保护性。结果表明ROP5重组蛋白疫苗免疫BALB／c小鼠诱导机体产生高水平的IgG、IgG1、IgG2a抗体和IFN—y、IL-2及IL-10细胞因子。与PBS及佐剂对照组相比，重组蛋白免疫组小鼠的存活时间明显延长。本实验证实了ROP5重组蛋白免疫BALB／c小鼠能够诱导其产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答，以及一定的抗弓形虫感染保护作用。

弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5基因的表达研究

为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5(Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5)基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期(速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊)中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。

弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白研究的新进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫。因其复杂的生活史和致病机理,目前尚无有效的专用药物进行治疗。近年来,关于抗弓形虫免疫及疫苗的研究逐步深入,棒状体颈部蛋白(RONs)及棒状体蛋白(ROPs)作为重要的抗弓形虫疫苗的候选抗原分子,广泛应用于新型抗弓形虫疫苗的研究中。本文总结了近几年来弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白的研究新进展,尤其是这些RONs及ROPs作为新型DNA疫苗分子研究的最新进展。

弓形虫分泌蛋白ROP5的全基因原核重组表达与抗原性鉴定

目的在大肠杆菌工程菌中重组表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白5(ROP5)的融合蛋白GST-6×His-ROP5,并初步评价重组蛋白的抗原性。方法体外细胞培养弓形虫速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP5基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,最后通过Western blotting鉴定重组蛋白rROP5的抗原性。结果构建了弓形虫ROP5全基因重组表达质粒,诱导表达了GST-6×His-ROP5融合蛋白,分子量为96 kDa,与预测结果相符,重组蛋白与人源抗血清有显著免疫印迹反应。结论本研究获得了弓形虫ROP5全长重组蛋白,为进一步改进弓形虫诊断抗原,研究蛋白结构以及分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

马泰勒虫棒状体颈部蛋白5基因的克隆与原核表达

从马泰勒虫新疆分离株PCR扩增棒状体颈部蛋白5(ron5)基因,构建pGEX-4T-ron5表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)进行原核表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,以谷胱甘肽S-转移酶标签兔单抗(1:2000)和马泰勒虫感染马阳性血清(1:100)作为一抗,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和兔抗马IgG(1:5000)为二抗进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。马泰勒虫新疆分离株的ron5基因长1434 bp,提交GenBank获得的登录号为OP777492。序列比对结果显示,马泰勒虫新疆分离株ron5的核苷酸和氨基酸序列与马泰勒虫WA株(GenBank登录号XM 004833657)的序列一致性最高,分别为99.6%和99.2%。系统进化树分析结果显示,马泰勒虫新疆分离株与马泰勒虫WA株聚在同一支上,二者亲缘关系最近。SDS-PAGE分析结果显示,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3 h时,RON5的表达量最高;RON5的相对分子质量(Mr)约为79000,主要以包涵体形式表达。Western blotting分析结果显示,RON5可被谷胱甘肽S-转移酶标签抗体和马泰勒虫感染马血清识别,在Mr 79000处有明显条带。本研究克隆了ron5,表达的RON5具有较好的抗原性。

弓形虫ROP21诱饵质粒的构建与自激活鉴定

目的筛选与弓形虫ROP21相互作用的宿主蛋白。方法构建弓形虫ROP21基因的三个诱饵载体,通过酵母双杂交技术分别对其在Y2H Gold酵母菌中的毒性和自激活进行鉴定。提取弓形虫RNA并进行反转录,采用RT-PCR方法扩增得到弓形虫ROP21全长序列,根据其不同功能区构建全长或部分序列诱饵质粒,测序后分别命名为pGBKT7-ROP21、pGBKT7-LC和pGBKT7-ST。将重组的诱饵载体转化到Y2H酿酒酵母菌,在营养缺陷型培养基上观察该重组诱饵载体的毒性和自激活现象。结果发现三个质粒转化酵母菌后,pGBKT7-ROP21和pGBKT7-ST存在自激活现象,而pGBKT7-LC转化酵母菌不存在,因此其可以作为酵母双杂交筛选的诱饵质粒。结论为进一步运用酵母双杂交技术筛选与弓形虫ROP21互作的宿主蛋白奠定了基础。

弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗研究现状

弓形虫病目前尚无理想的特效治疗药物和防治措施,研制安全便捷、保护力强的核酸疫苗是弓形虫病防治的有效策略。棒状体蛋白(Rhoptry protein,ROPs)是弓形虫在入侵宿主细胞过程中所分泌的一类蛋白,其在弓形虫入侵宿主细胞、纳虫空泡(Parsitophorous vacuole,PV)形成及胞内弓形虫的增殖调控等方面发挥着重要作用,是最具潜力的疫苗候选抗原分子之一。本文就ROPs家族重要成员特性、表达载体选择及其核酸疫苗在动物实验中的免疫原性,以及免疫保护作用等方面进行了概述。