全自动基因指纹分析仪Riboprinter在药品中大肠埃希菌的鉴定分析中的应用(英文)

目的鉴定分析药品中分离的大肠埃希菌可疑菌。方法参照中国药典等文献,采用VITEK微生物鉴定仪对其鉴定,同时采用RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统对其进行鉴定和溯源。结果可疑菌与大肠埃希菌生化特性相符,限制性内切酶EcoR I的酶切图谱与RP数据库中的大肠埃希菌一致,并且与标准菌株相似。结论 RiboPrinter分型结果和分子溯源功能能有效的应用于药品可疑菌的检验。

杜邦Qualicon率先推出以DNA为基础的RiboPrinter自动微生物鉴定系统

迄今，这是全球唯一自动化的DNA指纹仪器，用于鉴定微生物并表现其特征。它赋予了微生物鉴定前所未有的准确性、运行速度、分辨率、可重复性和信心。

两种快速细菌菌种鉴定方法的比较

采用Riboprinter全自动核糖体RNA指纹分析系统,进行了两株送测细菌的鉴定,同时与16S rDNA序列测定结合生理生化实验的方法进行比较。结果表明,两种方法均成功、快速地完成了送测菌株的鉴定,其分别为大肠杆菌和铜绿假单胞菌。相比而言,Riboprinter系统更为简洁,可以在8h内完成未知菌株的鉴定,最大化避免了其他因素对实验的影响,且在鉴定到种的基础上可以进一步分类,进行溯源分析。

一种罕见的福氏志贺菌4c型流行菌株的鉴定分析

目的鉴定、分析新出现的福氏志贺菌4型流行菌株的表型和DNA型别特征。方法在部分测试典型菌株用生化、血清型别及药敏试验等的基础上结合R iboprinter DNA指纹图谱分析系统(RP)来分析鉴定测试菌。结果该类菌株表型符合志贺菌定义,血清学分型为福氏志贺菌4 c型(F4 c,Ⅳ:7,8);限制性内切酶EcoRⅠ的酶谱与RP数据库中志贺菌一致,PvuⅡ的酶切结果发现,参考菌株中有1株F2b地方株与F4 c酶谱一致。结论福氏志贺菌4 c型可能是F2b的溶源性变异菌株。应用RP双酶切福氏志贺菌具有分子鉴定和分子分型的作用。

不典型山夫登堡沙门菌流行菌株的鉴定

目的对新出现的硫化氢(H2S)阴性山夫登堡沙门菌流行菌株进行鉴定。方法比较腹泻患者分离的山夫登堡沙门菌落、生化、耐药表型和沙门菌毒力岛1(SPI-1)的编码基因表型(hilA、invA),使用Riboprinter(进行核糖体指纹图谱分型,脉冲凝胶电泳(PFGE)选用XbaⅠ限制性内切酶,聚类软件选用BioNumerics软件。结果 2006年30株山夫登堡沙门菌腹泻菌株中,确认12株属于H2S和hilA、invA基因均阴性的表型不典型菌株;所有菌株除对四环素有较高耐药性(75.6%)外,对其他测试抗菌药物均较敏感;Riboprinter(核糖体分型图谱证实不典型与典型山夫登堡沙门菌在遗传学上属独立的克隆;PFGE分型将34株腹泻株分成16个带型,11株不典型菌株间存在90%的遗传学同源,优势带型为6型(6株)和4型(3株);13株典型菌株间有80%的遗传学同源,优势带型为17型(5株)、23型(5株)和11型(3株),不典型与典型菌株分别聚类成2个克隆族。结论生化、基因表型和遗传学特征不典型的山夫登堡沙门菌构成了2006年上海市山夫登堡的多点暴发病例,建议使用经过优化的常规和分子生物学方法以避免临床实验室对表型不典型沙门菌株的漏检。

应用全自动核糖体RNA基因指纹技术快速鉴定细菌菌种

应用RiboPrinter全自动核糖体RNA基因指纹技术对4株未知菌种进行快速鉴定,并与生理生化试验结合16SrDNA序列测定方法相比较。结果表明,两种方法均成功地完成了4株未知菌种的鉴定,其结果分别为大肠杆菌、嗜热链球菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。相比之下,生理生化试验结合16SrDNA序列测定的方法经济实用,而RiboPrinter系统更为简便、快速,在8h内快速地完成了4株未知菌种的鉴定,并且为菌株的基因分型以及溯源分析奠定了基础。

16S rDNA在乳酸菌菌种鉴定及聚类分析上的应用

近年来,微生态制剂日益受到市场关注。市售微生态食品以益生菌酸奶或乳酸饮料为主,其中活的乳酸菌含量及菌株特性是决定微生态制剂质量的关键。目前常用的菌种鉴定技术包括生理生化方法或PCR方法,前者工作量大周期长,后者需要专业人员操作,且难以区分死活细菌。本文选取了11种市售的乳酸菌产品,采用MC、MRL、TPY等乳酸菌专用培养基进行乳酸菌计数及菌种分离,进一步用荧光定量PCR方法验证了产品中常规培养法难以分离的双歧杆菌,在此基础上,采用Riboprinter基因指纹图谱分析仪,对分离自11种酸奶样品的16株乳酸菌菌进行了核酸水平的鉴定,建立了16S rDNA聚类分析分子图谱,方便并简化对微生态产品的质量进行"物证相符"的考证,初步分析了目前市场上市售酸奶所用菌种的种属相关性。

广东省副溶血性弧菌rDNA指纹图谱特征分析

目的通过对广东省监测食品及腹泻病人中分离的副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus，VP）进行rDNA（核糖体核酸）指纹图谱分析，为VP引起的食物中毒事件流行病学调查提供诊断依据。方法对从2003～2004年广东省食品及食物中毒病人中分离的64株VP采用RiboPrinter微生物鉴定系统进行核糖分型，并利用RiboExplorer软件处理rDNA指纹图谱，运用Bio Numerics软件分析菌株的同源性。结果64株VP共分为51个核糖型，其中源自食品的52株分离株分为41个核糖型，源自食物中毒病人的12株分离株分为10个核糖型。来源于同一起食物中毒的E408-18-S-7核糖型的3株VP其相似度为100％，其他病人株均非同型或相似度较低（〈95％）。结论监测地区食品分离株核糖型多、分布广，有部分核糖型相似度较高；rDNA指纹图谱对于同一核糖型或相似度〉95％的菌株能达到溯源能力。

不同地域阪崎肠杆菌基因型的研究和亲缘分析

对实验室分离的34株来自10个国家,5大洲的阪崎肠杆菌进行基因分型。利用BioNumerics软件对这34株菌分国家和大洲进行了亲缘关系的分析。亲缘分析的结果显示来自不同国家和不同大洲的阪崎肠杆菌有可能是基因型相似的菌株,而来自同一个国家的同一份样品中分离得到的两株阪崎肠杆菌则可能亲缘关系很远。

药品微生物实验室水系统分离37株微生物的鉴定及分析

目的针对目前国内微生物实验室试验用水的实际情况,探索试验用水微生物群落的组成及分布规律。方法参考国内外药典对纯化水微生物的检验方法,收集某实验室7个纯水使用点的纯化水,经薄膜过滤法处理,采用R2A琼脂培养基培养、分离和纯化,并进行革兰染色。分别运用基因型鉴定方法(16S rDNA序列分析、Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统),生化鉴定方法(Biolog自动微生物鉴定系统)对检出微生物进行鉴定,并对实验结果进行分析比较。结果本研究共培养获得37株细菌,主要为鞘氨醇单胞菌属和叶杆菌属等。16S rDNA序列分析能对37株微生物达到属或属水平以上的鉴定,Biolog自动微生物鉴定系统鉴定出13株微生物,Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统鉴定出17株微生物。结论16S rDNA序列分析适合对水系统中的微生物进行基于培养的群落分布分析,Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统更适用于同种/属细菌的分型及溯源分析。

金黄色葡萄球菌分离株自动化核糖体分型的研究

运用自动化核糖体基因分型系统(Riboprinter),用EcoRI酶,对实验室分离的31株金黄色葡萄球菌进行分子分型研究。31株菌均被鉴定为金黄色葡萄球菌,并获得25种Riboprinter核糖体基因条带型。

农产品中食源性致病菌的污染状况分析

目的了解农产品中食源性致病菌的污染状况,为政府监管提供依据。方法共抽取430份农产品样品,监测项目为沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7、霍乱弧菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌和诺如病毒。采用全自动基因指纹分析仪对分离到的部分沙门氏菌和金黄色葡萄球菌株进行核糖体基因指纹鉴定。结果农产品中存在食源性致病菌的污染,畜禽产品中检出单核细胞增生李斯特氏菌22株、沙门氏菌17株、金黄色葡萄球菌7株;水产品中检出霍乱弧菌7株;鲜食蔬菜中检出金黄色葡萄球菌11株,72%的金黄色葡萄球菌产肠毒素。全自动基因指纹分析仪的鉴定结果和国标方法完全一致。结论应重视农产品的源头污染,加强监控。全自动基因指纹分析仪可用于食源性致病菌的快速鉴定和溯源。

PCR及核糖体基因分型法检测和鉴定脂环酸芽孢杆菌

为实现对果汁生产中脂环酸芽孢杆菌从原料到成品的快速检测和鉴定,采用聚合酶链式反应(PCR)以及自动化核糖体基因分型RiboPrinter,对经过分离、筛选和纯化后的59株分离菌株进行鉴定。结果表明:自动化核糖体基因分型使得鉴定结果更加快速、准确和可靠,最大化避免了其他因素对实验的影响,且在鉴定到种的基础上可以进一步分类,进行溯源分析。RiboPrinter分型结果为建立我国脂环酸芽孢杆菌分子分型数据库积累了一定的数据和经验,但由于菌株的来源地及数量有限,因此尚不能看出核糖体基因型是否有明显的地域分布特征。

注射剂微生物污染的RiboPrinter~?微生物基因指纹系统鉴定及同源性分析

目的对注射剂的无菌检查阳性结果进行核糖体分型鉴定,并根据鉴定结果进行微生物污染的来源分析。方法采用RiboPrinter■微生物基因指纹系统对阳性菌A1和污染调查中采集菌株中的的16株葡萄球菌进行鉴定和同源性分析。结果 RiboPrinter■微生物基因指纹系统的鉴定结果与菌株的生化鉴定结果完全相同;A1的鉴定结果为科氏葡萄球菌,溯源自无菌检查实验的环境污染。结论基于核糖体分型原理的RiboPrinter■微生物基因指纹系统鉴定结果准确可靠,可用于鉴定及同源性分析污染的微生物。

《中国药典》拟收载洋葱伯克霍尔德菌群(Bcc)检查法中标准菌株的稳定性研究

目的:应用现有微生物分类鉴定技术手段,对《中国药典》拟收载洋葱伯克霍尔德菌群(Bcc)检查法中所选用的标准菌株进行冻存及传代稳定性考察。方法:选取美国药典USP43-NF38 Bcc检查法中的一株Bcc标准菌株ATCC25416为对照菌株。以3株拟收载标准菌株和1株对照标准菌株为试验菌株,分别对这些试验菌株冻存0.5年、1年、2年的样本及连续6代的传代样本进行菌落表型观察、Biolog生化鉴定分析、16S rRNA基因测序及Ribo Printer全自动基因指纹图谱分析,并使用Bio Numerics 7.6对核糖体图谱数据进行聚类分析。结果:试验菌株在经冻存及传代后,各菌株表型无明显差异;菌株的Biolog生化鉴定结果虽略有差异,但菌株关键生化代谢属性稳定,其鉴定结果均属Bcc;同时,各菌株的16S rRNA测序结果一致;核糖体带型相似值均大于0.95。结论:在本研究考察的冻存时间及传代次数内,3株《中国药典》洋葱伯克霍尔德菌群检查法拟收载的标准菌株的表型、基因型相对稳定。

上海市山夫登堡沙门菌流行特征和分子分型研究

目的分析上海市2006—2007年山夫登堡沙门菌分离株的分子流行病学特征。方法追溯2002--2007年山夫登堡沙门菌食品分离株的来源；对2005--2007年从腹泻病例分离的山夫登堡沙门菌进行生化和hilA、invA基因表型鉴定、药敏试验、Riboprinter （RP）核糖体分型和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析。结果2006年山夫登堡沙门菌列上海市非伤寒沙门菌监测确认病例第3位，2002--2005年的食品分离株主要源自猪和牛肉制品。所有腹泻病例分离株除四环素（75．6％）外对其他抗生素均有较高敏感性。经RP和PFGE分子分型将硫化氢和hilA、invA基因全部有和无的两组菌株分别归属两类在遗传学上相对独立的克隆族。34株腹泻病例分离株分为16种PFGE带型，以同源程度较高的4型（4株）、5型（1株）、6型（6株）、7型（1株）共12株菌和11型（3株）、17型（5株）、23型（5株）共13株菌等优势带型聚类成2个克隆族。结论2006年上海市山夫登堡沙门菌感染病例是经过一定时间积累演变，由2个不同表型PFGE克隆族菌株构成较为少见的多点暴发。2007年病例大幅减少和未监测到同一时期食品污染源的结果表明，菌株存在遗传克隆的不稳定性和传播途径的复杂性。

复方益肝灵制剂中检出微生物的分型溯源与产品质量评价

目的:对复方益肝灵制剂中检出的微生物进行鉴定与分型,评估产品微生物污染的风险,评价产品质量。方法:收集整理2014年国家药品评价性抽验中,复方益肝灵制剂共计138件,经微生物限度方法学验证,对制剂中检出的微生物共36株,利用革兰染色、镜检、生化鉴定、16S rDNA测序、Ribo Printer核糖体分型等方法,进行鉴定、分型与溯源。结果:生化方法无法有效鉴定该微生物污染物;核酸测序与核糖体分型的鉴定结果一致,均为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。核糖体分型的类聚分析结果表明:微生物污染物可分为2个亚型,其中亚型Ⅰ包含24个菌株,菌株间同源性关系>94%,亚型Ⅱ包含12个菌株,菌株间同源性关系>99%,2个亚型之间的同源性关系仅为87.2%;菌株分型结果与产品抽样批号的比较中发现,微生物各亚型的分布、同源性关系与产品的生产时段、生产批号呈现集中性和一致性的特点。结论:该制剂生产工艺流程中存在微生物污染的风险,应在生产过程中进行微生物监控,及时排查污染隐患。本研究通过上述案例分析,拟建立非无菌制剂中微生物的鉴定与分型方法及微生物污染物调查和追溯解决方案,为非无菌制剂的质量控制、监督抽验和用药风险评估提供技术手段和数据支持。

迟缓爱德华氏菌EcoRⅠ核糖体自动化分型与聚类分析

【目的】对26株迟缓爱德华氏菌进行自动化核糖体分型,并进行聚类分析。【方法】采用RiboprinterTM全自动微生物鉴定系统对分离自斑点叉尾鮰、日本鳗、多宝鱼、比目鱼、斑醴等宿主体内的迟缓爱德华氏菌进行核糖体分型,以限制性内切酶Eco RⅠ处理、切割菌株DNA;运用Bio Numerics软件分析图像数据。【结果】迟缓爱德华氏菌核糖体图谱与数据库中已有信息进行比对,ATCC15947和BYK00685的比对相似值>0.85,分别为0.95及0.90。条形码经软件分析共产生21种核糖体条带,聚类分析分为3个群。条带之间呈现明显的地域性差异和宿主差别。来自北方及南方的菌株除少数几株以外,各自聚集为一个群;所有人源株则分布在第三群。【结论】自动化核糖体分型可以方便快捷地用于不同物种的菌株分型与流行病学追踪溯源。

金黄色葡萄球菌分型方法的建立及应用

目的建立食源性金黄色葡萄球菌的分型与溯源方法。方法以血浆凝固酶为目标基因,通过PCR方法对食源性金黄色葡萄球菌进行鉴定,同时借助全自动微生物基因指纹鉴定系统(RiboPrinter)对其进行分型和类聚状况分析。结果 PCR方法可特异性鉴定金黄色葡萄球菌,RiboPrinter方法可将金黄色葡萄球菌分为6个亚型,各亚型类聚状况平均分布。结论上述方法的建立可准确地将金黄色葡萄球菌进行鉴定和分型,分析类聚分布与同源性关系,为食源性致病菌的快速鉴定与分型溯源提供技术手段。

一类罕见H_2S阴性山夫登堡沙门菌腹泻株的研究

目的:研究一类罕见H2S阴性山夫登堡沙门菌腹泻菌株遗传克隆特征。方法:收集、分析本地区参加全球沙门菌监测(GSS)腹泻病例中分离的山夫登堡沙门菌生化、编码SPI-1毒力岛基因(hilA、invA)和耐药特征;应用Riboprinter(RP)DNA指纹图谱系统比较表型典型与不典型菌株的核糖体型;通过PluseNet China数据库中同型菌株的脉冲凝胶电泳(PFGE)图谱聚类比较分子型谱。结果:2006年卢湾区GSS监测病例分离4株山夫登堡沙门菌中有2株属于H2S阴性和SPI-1毒力岛缺失的表型变异菌株。RP分型证实发生变异的山夫登堡沙门菌与典型菌株间分属2个不同的克隆。PluseNet China数据库将包括卢湾区4株山夫登堡沙门菌在内共36株山夫登堡腹泻株共分18种PFGE带型。卢湾区的2株表型变异株分属4型和5型,2株典型菌株分属11型和23型。聚类分析显示表型变异株的克隆在遗传相似度上高于典型株。结论:分子溯源证实SPI-1毒力岛缺失的山夫登堡沙门菌变异菌株与典型菌株同样具有引发局部暴发的致病性,2006年卢湾区分离的H2S阴性山夫登堡沙门菌变种腹泻株与2002年深圳市的1例食物中毒案例分离的2株SPI-1毒力岛缺失株存在同源性。