Ribozyme是唯一的非酶生物催化剂吗?

人们一直认为酶是唯一的生物催化剂，酶和生物催化剂概念具有等价性。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ的发现打破了这种等价性，生物催化剂上升为属概念，酶和ｒｉｂｏｚｙｍｅ并列成为种概念。随着研究的深入，人们发现ＤＮＡ也具有催化活性。本实验室对博莱霉素（ＢＬＭ）的研究表明，ＢＬＭ介导的ＤＮＡ断链反应具有许多类似酶促反应的特性，并推测ＢＬＭ和生物体内的许多辅酶可能是生物催化分子进化过程中保留下来的古老而简单的小分子生物催化剂。可以断言ｒｉｂｏｚｙｍｅ并非唯一的非酶生物催化剂。

抗c-erbB-2 ribozyme的计算机设计

目的:设计能特异性切割人癌基因c-erbB-2 mRNA的核酶(ribozyme).方法:根据Symons的“锤头结构”,以人癌基因c-erbB-2 mRNA为靶RNA,用计算机对其可能为核酶切割的位点进行分析以寻找最佳切点;对底物及核酶的二级结构进行预测.结果:c-erbB-2mRNA第2428～2776位和第2820～3004位之间的二级结构相对稳定,是重要的生物学功能区,因而也是核酶理想的攻击区域.该区第2438,2477,2751位是核酶的最佳切割位点.针对这三个位点设计了三个核酶并分别命名为RZ1,RZ2,RZ3.计算机模拟显示,它们均能与底物切点两翼碱基结合而形成锤头状结构.通过计算机基因库检索,在已知人基因中,其它基因的mRNA均不含有上述三个核酶切点两翼碱基的同源序列.结论:并非所有的GUX或CUX均可作为核酶的理想切割位点,c-erbB-2mRNA上第2438,2477,2751位可能是核酶的最佳切割位点.

Ribozyme和靶RNA的相互作用对于切割反应的影响

锤头结构Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｒｚ）通过与靶ＲＮＡ上切卢、二狈帕５核普酸序列的碱基配对识别和切割靶ＲＮＡ。通过改变Ｒｉｂｏｚｙｍｅ与靶ＲＮＡ之间碱基配对的长度以及性质，研究了Ｒｉｂｏｚｙｍｅ与靶ＲＮＡ相互作用对于它的切割反应的影响。结果表明：（１）缩短碱基配对长度和改变碱基配对的性质，使Ｒｉｔｉｏｚｙｍｅ与底物的熔卢、（Ｔｍ）降低，同时反应最适温度（Ｔｏｐｔ）也降低。（２）动力学分析表明，反应的Ｋｍ值随温度升高而增加，当温度接近或高于Ｒｉｂｏｚｙｍｅ与底物的熔点时，Ｋｍ值增加大大加快。（３）反应的Ｋｃａｔ也随温度升高而增加，但Ｋｃａｔ增加的速度继而逐渐变慢，最后Ｋｃａｔ下降。

目的Ribozyme两侧长片段附加序列（LAS）的去除及其转录载体构建

选择小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ特异Ｒｉｂｏｚｙｍｅ做为目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（Ｒｚ），在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ两侧分别设计５＇－顺式Ｒｚ和３＇－顺式Ｒｚ，在目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ上设计ＢａｍＨＩ酶切位点，并构建了上述Ｒｉｂｏｚｙｍｅ转录载体ｐＳＣＲｚ２６２，采用该质粒进行体外转录，并对转录靶ＲＮＡ分子进行了切割反应。结果显示ｐＳＣＲｚ２６２在转录过程中发生了自身切割，并释放出目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ－Ｒｚ２６２，该目的Ｒｉｂｏｚｙｍｅ不但去除了两侧长片段附加序列，而且保持了正确的生物学活性，通过ＢａｍＨＩ切点的设计简化了该质粒的筛选。

抗HPV16 E7-ribozyme在CV-1细胞中的稳定表达

构建了由RSV-LTR启动子带动并能在细胞内稳定复制的Ribozyme的自身修剪表达质粒pRSV-Rz523、Ribozyme反义对照质粒pRSV-AE7及人增殖细胞核抗原基因(PCNA)启动子带动的HPV16 E7片段(+554～+686)的真核表达质粒pPCNA-E7。经G418抗性筛选获得了稳定表达Ribozyme的CV-1细胞克隆,其表达水平约为9.0pmol/10~6个细胞,其中活性Ribozyme的量大于50fmol/10~6个细胞,分离得到的Ribozyme可在体外特异切割E7靶RNA片段。通过共转染Ribozyme(或反义对照)和底物表达质粒并筛选出细胞克隆,研究了Ribozyme在细胞中对底物表达水平的影响。初步结果显示,Ribozyme的导入可使细胞内底物E7的RNA表达水平降低了90％(反义对照使E7 RNA表达降低20％)。上述结果提示:在CV-1细胞中表达的Ribozyme不仅在体外,同时在细胞内具有一定的生物学活性,有可能应用于逆转宫颈癌细胞的恶性表型。

抗猪瘟病毒Ribozyme基因表达载体的构建

根据猪瘟病毒（ＨＣＶ）基因组ＲＮＡ的序列和Ｒｉｂｏｚｙｍｅ的结构特点，设计并合成了针对ＨＣＶ基因组Ｐ（８０）编码区长为５６碱基对（ｂｐ）的榔头状ＨＣＶＲｉｂｏｚｙｍｅ（ＨＲ）基因。将此基因插入质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中，转化ＸＬ１－ｂｌｕｅ细胞，经限制性内切酶鉴定，获得６个阳性克隆ｐＢＨＲ。可用于ＨＣＶ抗性的体外表达研究。又将羊金属巯因启动子（ｏＭＴ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ）插入ｐＢＨＲ，构建重组质粒ｐｏＭＨＲ，经序列分析插入的ＨＲ基因序列和方向与设计相符。再将ｏＭＴＨＲ基因插入质粒ｐｍＭＴ中，最终构成ｐＭＨＲ表达载体，经酶切分析和聚合酶链式反应（ＰＣＲ）鉴定表为此表达载体中确含ｏＭＴ启动子和ＨＣＶ－Ｒｉｂｏｚｙｍｅ基因，可用于ＨＣＶ抗性的体内表达研究。

RNA研究进展之一:Ribozyme

Cech和Altman因发现酶活性RNA(Ribozyme)而获得1989年诺贝尔化学奖。本文重点介绍Ribozyme的应用研究。现在已知的Ribozyme绝大部分参与RNA的加工和成熟。它们可以分为四类。(1).

Ribozyme研究现况与展望

Ｒｉｂｏｚｙｍｅ研究现况与展望祁国荣（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词Ｒｉｂｏｚｙｍｅ近年来，ｒｉｂｏｚｙｍｅ研究进入一个平稳发展阶段，没有太大的突破。关于ｒｉｂｏｚｙｍｅ在体内阻断基因表达和抗病毒的前景，能否用作临床药物，还难...

Ribozyme——分子病毒学的新领域

Ribozyme是具有催化RNA切割反应功能的RNA,它可以有效地序列特异性地切割RNA。最近,Ribozyme的一般结构已经被证实,因此能够设计并人工合成Ribozyme,通过切割破坏RNA,阻断其功能,并抑制基因表达,包括抑制病毒的基因表达,从而有效地阻止病毒的复制和繁殖。这是近年来继反义RNA之后发现的又一个抑制基因表达的有力工具,它开辟了分子生物学的一个新领域,具有很大的潜在应用价值,因此它一出现即引起各国学者的极大兴趣。

细胞核内反义RNA和反义ribozyme-基因表达抑制新途径

细胞核内反义ＲＮＡ和反义ｒｉｂｏｚｙｍｅ－基因表达抑制新途径张德礼高步先高显明邓柏林朱关福１北京军区后勤部卫生防疫队、北京军区兽医防治中心北京１０００７１；１中国军事医学科学院微生物流行病学研究所北京１００８５０关键词细胞核反义ＲＮＡ反义ｒｉｂｏｚｙ...

抗HPV16E7－ribozyme的体外制备与活性鉴定

通过体外转录结合乙醇沉淀，建立了体外大量制备抗ＨＰＶ１６Ｅ７－Ｒｚ的方法。切割实验表明，ｒｉｂｏｚｙｍｅ可在体外准确和有效地切割Ｅ７靶ＲＮＡ，形成８５ｎｔ和８６ｎｔ大小的切割产物。体外制备的ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性、Ｋｍ和ｋｃａｔ值与人工合成的相似。结果说明，体外制备的ｒｉ－ｂｏｚｙｍｅ具有特异的催化切割活性。

Ribozyme与基因表达

Ribozyme指一类具有生物催化功能的RNA,也称RNA催化剂、在化学本质上,它不同于具有生物催化功能的蛋白质——酶(enzyme),Ribozyme发现于80年代初,近十年来,ribozyme研究进展深化了生物催化理论,提出了生物大分子和生命起源的新概念。

核糖核酸和焦炭酸二乙酯修饰影响ribozyme切割活性的初步研究

以抗HPV16E7－ribozyme作为研究模型，对影响ribozrme切割活性的一些因素进行了初步探讨。结果发现，核糖核酸（RNA）可以明显影响ribozyme的体外切割活性，且其活性随着加入反应的RNA量和RNA种类的不同而异，细胞内的RNA可能会明显影响ribozyme的体内切割活性。另外，ribozyme的焦炭酸二乙酯修饰也可明显影响ribozyme的切割活性，说明ribozyme保守序列中的腺苷酸（A）对其活性的维持是重要的。

小鼠腺苷脱氨酶mRNA特异Ribozyme计算机设计

小鼠腺苷脱氨酶ｍＲＮＡ经计算机分析，包括：ｒｉｂｏｚｙｍｅ切点位置选择，二级结构预测，基因生物学功能和基因同源性分析，筛选出四个锤头结构ｒｉｂｏｚｙｍｅ．结果表明上述ｒｉｂｏｚｙｍｅ底物切点两翼碱基形成发夹结构，切点位于单链环区，切点所在基因片段位于该基因生物功能区内，并同已知小鼠其它基因不同源．

Ribozyme在疾病治疗中的应用

Ribozyme具有催化切割其他RNA分子的能力,不少研究者针对这一特点,试图通过人工设计的Ribozyme破坏致病的RNA分子,在爱滋病、慢性肝炎和癌症等疾病的治疗上做了大量探索性的工作,对存在的许多问题提出了相应的解决方法。这方面的研究预示着Ribozyme在临床治疗上的应用前景。

细胞核内反义RNA和反义ribozyme——基因表达抑制新途径

近年来,新采用的反义技术已有细胞核内反义RNA和Antizyme。前者是指将反义RNA限制于细胞核内抑制靶基因原始转录子,以避免在细胞浆需抑制极其巨大数量的靶RNA,而起到把问题解决在萌芽状态的独特作用,这种模拟真核生物天然存在反义RNA封闭基因表达机制的高效方法,无疑开辟了一条抑制基因表达的新途径。后者是反义ribozyme,即ribozyme基因与反义RNA基因相连接,转录成具有ribozyme和反义RAN双重功能的一类RNA分子,实际上是基因剪刀和基因表达封条的联合体。目前,它在转基因植物研究方面,应用比较广泛。从研究进展、存在问题、发展对策和应用前景四方面评述细胞核内反义RNA和反义ribozyme是抑制基因表达的新途径。

酶活性RNA（Ribozyme）的发现及其认识论

酶活性ＲＮＡ是一类具有携带遗传信息和催化作用双重功能的ＲＮＡ分子，这一发现打破了“酶的本质是蛋白质”的传统观念。利用Ｒｉｂｏｚｙｍｅ所进行的基因干预和基因治疗展现出重要的实用价值。这一事实告诉我们科学实验是科学发展的动力，是检验真理的标准，科学的发展永无尽头，人类的认识没有止境。

抗HPV16E7－ribozyme和靶RNA相互作用的计算机分析

应用计算机分析了抗ＨＰＶ１６Ｅ７－ｒｉｂｏｚｙｍｅ的体外切割反应结果，发现ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ的二级结构及其能量变化能影响ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性。根据锤头结构ｒｉｂｏｚｙｍｅ的能量变化模型，对抗ＨＰＶ１６Ｅ７－ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ在痘苗表达体系及稳定表达体系中的相互作用，进行计算机模拟分析。结果表明，计算机分析ｒｉｂｏｚｙｍｅ和靶ＲＮＡ在细胞内的相互作用，可以指导ｒｉｂｏｚｙｍｅ的设计和在体内的应用研究。

定点切割甲型肝炎病毒RNA片段的Ribozyme的设计和性质的研究

Ribozyme是一类具有生物催化功能的RNA,它能定点切割RNA靶分子,从而达到有效地阻断基因表达的目的。本文依“锤头结构”原理设计合成了一个38个核苷酸的Ribozyme,能在体外定点切割甲型肝炎病毒的RNA片段(链长为123核苷酸残基,切削点对应于甲肝病毒RNA的559位)。测定了切割反应与温度、Ribozyme浓度和底物浓度的关系,其Km和kcat分别为0.63μmol/L和0.12min^(-1)。Mg^(2+)或Ca^(2+)均可作为参与该催化反应所必需的金属离子。

Ribozyme及其在医学上的应用前景

本文简要介绍了各类Ribozyme的催化机制,Ribozyme的人工设计及其在医学上的应用前景。