荣筋拈痛方对膝关节软骨细胞外基质代谢的作用及机制

背景:课题组前期动物实验研究表明,荣筋拈痛方可通过LncRNA GAS5/miR-21影响软骨基质分解和合成代谢,以达到防治膝骨关节炎的作用。LncRNA GAS5/miR-21能否作为防治膝骨关节炎的靶点,仍需从细胞水平研究验证。目的:从细胞水平探讨荣筋拈痛方防治膝骨关节炎的作用机制。方法:(1)8周龄SPF级雄性SD大鼠40只,随机分组后给予生理盐水、荣筋拈痛方(0.45 g/mL)、盐酸氨基葡萄糖胶囊(0.015 g/mL)灌胃,制备含药血清。(2)分离培养SD大鼠膝关节软骨细胞,采用白细胞介素1β干预软骨细胞,诱导退变软骨细胞模型,采用CCK-8法明确含药血清干预软骨细胞的量效时效关系。(3)将第2代软骨细胞分为空白组(空白血清)、模型组(白细胞介素1β+空白血清)、治疗组(白细胞介素1β+荣筋拈痛方含药血清)、对照组(白细胞介素1β+盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清)诱导干预48 h,Real-time PCR法和Western blot法检测各组软骨细胞血清干预后LncRNA GAS5、miR-21、基质金属蛋白酶抑制物3(tissue inhibitor of metalloproteinases 3,TIMP-3)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)3、MMP-9、MMP-13和解聚蛋白样金属蛋白酶5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS-5)基因及蛋白表达。(4)慢病毒转染软骨细胞过表达LncRNAGAS5,分为LncRNAGAS5空载体+空白血清组、LncRNAGAS5空载体+荣筋拈痛方含药血清组、LncRNA GAS5过表达+空白血清组、LncRNA GAS5过表达+荣筋拈痛方含药血清组,各组干预后Real-time PCR检测LncRNA GAS5、miR-21、TIMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因表达。结果与结论:(1)荣筋拈痛方含药血清体积分数为10%、培养48 h;盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清体积分数为15%、培养48 h,能显著提高软骨细胞活性;(2)干预48 h后,与模型组相比,荣筋拈痛方含药血清和盐酸氨基葡萄糖胶囊含药血清均能抑制Lnc RNA GAS5、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因和蛋白的表达(P<0.05),促进miR-21、TIMP-3基因和蛋白表达(P<0.05);(3)与空载体组相比,LncRNAGAS5过表达组LncRNA GAS5、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5基因表达量明显升高(P<0.05),miR-21、TIMP-3基因表达量明显降低(P<0.05);与LncRNAGAS5过表达+空白血清组相比,LncRNAGAS5过表达+荣筋拈痛方含药血清组MMP-9、MMP-13和ADAMTS-5mRNA表达量均降低(P<0.05),miR-21、TIMP-3基因表达量升高(P<0.05);(4)结果表明,荣筋拈痛方通过调控LncRNA GAS5/miR-21,促进TIMP-3的表达,抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-5等表达,从而延缓退变软骨细胞外基质降解,起到防治膝骨关节炎的作用。

荣筋拈痛方对膝骨关节炎大鼠软骨组织Beclin1及LC3B表达的影响

目的:观察荣筋拈痛方对膝骨关节炎大鼠软骨组织自噬的影响,探讨其防治膝骨关节炎的作用机制。方法:将24只SD大鼠按照随机分层法分为假手术组、模型对照组、荣筋拈痛方组,每组8只。除假手术组外,其他组采用改良Hulth法复制膝骨关节炎模型。给药12周后,从假手术组和模型对照组中随机抽取3只大鼠拍摄膝关节MRI,观察模型是否成功。采集大鼠膝关节组织,HE染色法观察软骨组织形态结构,采用Mankin病理评分对关节软骨进行组织形态学评分;免疫组织化学法观察软骨组织酵母自噬相关基因6同源物(Beclin1)及微管相关蛋白Ⅰ轻链3B(LC3B)的定位与表达。结果:MRI显示,假手术组关节间隙正常,关节面平整;模型对照组关节间隙增宽,关节软骨面不平整、局部缺损,结缔组织增生,骨赘形成。荣筋拈痛方组大鼠骨关节炎模型关节软骨的大体外观及HE染色均改善明显,Mankin软骨评分高于模型对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。荣筋拈痛方组自噬蛋白Beclin1及LC3B表达均呈上升趋势。结论:荣筋拈痛方可能通过提高自噬相关蛋白Beclin1、LC3B的表达,改善软骨细胞状态,延缓关节软骨退变。

荣筋拈痛方调控软骨基质代谢防治膝骨关节炎

背景:前期研究发现荣筋拈痛方能有效抑制软骨基质降解。长链非编码RNA GAS5可作为竞争性内源性RNA吸附miR-21-5p调控基质金属蛋白酶的表达,进而影响关节软骨基质代谢。但荣筋拈痛方是否通过长链非编码RNA GAS5/miR-21调控软骨基质代谢,发挥防治骨关节炎的作用机制有待深入研究。目的:从长链非编码RNA GAS5/miR-21调控软骨基质合成与分解代谢角度,探讨荣筋拈痛方治疗SD大鼠膝骨关节炎的作用机制。方法:SPF级8周龄雄性SD大鼠60只,随机分为4组,即空白组、模型组、治疗组及对照组,每组15只。后3组采用改良Hulth法建立大鼠膝骨关节炎模型。造模后2周,空白组和模型组予生理盐水,治疗组予荣筋拈痛方汤剂,对照组予盐酸氨基葡萄糖胶囊水溶液,每天灌胃一次,共干预12周。药物干预结束后取材,采用苏木精-伊红染色、改良番红O-固绿染色观察软骨组织显微结构形态变化,实时荧光定量PCR法检测长链非编码RNA GAS5、miR-21的表达及基质代谢因子mRNA的表达,Western blot法检测软骨组织中基质代谢因子蛋白的表达。结果与结论:(1)软骨显微结构观察,模型组软骨4层结构紊乱,排列不规律,潮线及黏合线不规则或消失,软骨细胞增生肥大且排列紊乱,软骨下骨增生,胶原、蛋白多糖大量丢失;治疗组和对照组软骨4层结构、潮线可辨,软骨细胞排列较规律,软骨下骨结构较完整,胶原、蛋白多糖部分丢失;(2)与空白组相比,模型组软骨组织中长链非编码RNA GAS5及基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5 mRNA表达量升高(P<0.01或P<0.05),治疗组、对照组与模型组相比表达量降低(P<0.01或P<0.05);模型组软骨组织中miR-21及组织金属蛋白酶抑制因子3、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达量降低(P<0.01或P<0.05),治疗组、对照组与模型组相比表达量升高(P<0.05);(3)与空白组相比,模型组软骨组织中组织金属蛋白酶抑制因子3、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05),治疗组和对照组中表达升高(P<0.01或P<0.05);模型组软骨组织中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5蛋白表达升高(P<0.01或P<0.05),治疗组和对照组中表达降低(P<0.01或P<0.05);(4)提示荣筋拈痛方下调膝骨关节炎大鼠软骨组织中长链非编码RNA GAS5、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9等的表达,上调miR-21、组织金属蛋白酶抑制因子3、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达,影响软骨基质分解和合成代谢,减少软骨基质中胶原、蛋白多糖的丢失,延缓软骨基质降解,减轻软骨组织形态结构的破坏。

荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎软骨退变的作用机制

目的探究荣筋拈痛方调控LncRNA H19/miR-675延缓大鼠膝骨关节炎(KOA)软骨退变的作用机制。方法将46只8周龄雄性SD大鼠随机分为空白组(13只)与造模组(33只)。采用改良Hulth法复制大鼠KOA模型,造模2周后,随机选择2组中各3只大鼠拍摄膝关节MRI,鉴定造模是否成功。造模成功后,将30只造模组大鼠随机分为模型组、治疗组和对照组,每组各10只。各组予相应药液灌胃12周后,切取右侧胫骨平台软骨组织,采用Real-time PCR法检测软骨组织中LncRNA H19、miR-675、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因水平。结果与空白组比较,模型组软骨组织LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan基因水平均明显降低(P<0.05);与模型组比较,治疗组与对照组中LncRNA H19、miR-675、CollagenⅡ、Aggrecan基因水平水平均明显升高(P<0.05)。结论荣筋拈痛方可能通过上调LncRNA H19/miR-675促进CollagenⅡ、Aggrecan表达,从而延缓大鼠软骨退变,起到治疗KOA的作用。

计算机模拟研究荣筋拈痛方治疗骨关节炎的药效物质基础、作用靶点及作用特点

目的:从分子水平探讨荣筋拈痛方治疗骨关节炎(osteoarthritis,OA)的药效物质基础、作用靶点及作用特点。方法:通过检索北京大学中草药有效成分三维结构数据库、中药原植物化学成分手册和相关文献,共检索出荣筋拈痛方中有效化合物411个,在Discovery studio模拟平台上建立荣筋拈痛方化合物分子数据集。通过检索TTD数据库和相关文献,确定基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1、MMP-3、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、5脂加氧酶(5 lipoxygenase,5-LOX)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)为荣筋拈痛方治疗OA的靶点,从RCSB蛋白数据库下载其蛋白质晶体结构,在Discovery studio模拟平台上建立其蛋白分子数据集。通过分子对接和生物网络技术,构建荣筋拈痛方化合物-OA靶点作用网络,研究荣筋拈痛方治疗OA的药效物质基础、作用靶点及作用特点。结果:建立的荣筋拈痛方化合物-OA靶点作用网络中共有159个节点,包括7个OA靶蛋白节点和152个荣筋拈痛方化合物节点;7个OA靶蛋白节点中,MMP-1节点可以与90个化合物节点连接、MMP-3节点可以与18个化合物节点连接、i NOS节点可以与43个化合物节点连接、5-LOX节点可以与16个化合物节点连接、TGF-β1节点可以与40个化合物节点连接、IL-1β节点可以与109个化合物节点连接、TNF-α节点可以与53个化合物节点连接;152个荣筋拈痛方化合物节点中,约76.16%的化合物的作用靶点数量≤3个、11.26%的化合物的作用靶点数量≥5个。荣筋拈痛方的活性成分主要为苷类和黄酮类。荣筋拈痛方化合物-OA靶点的作用关系曲线遵循幂函数p(k)=k-1.79411规律。结论:荣筋拈痛方治疗OA的药效物质基础为苷类和黄酮类,主要作用靶点为IL-1β、TNF-α和MMP-1,在缓解疼痛及延缓软骨退变方面具有广谱的作用特点。

荣筋方联合谷胱甘肽防治结直肠癌奥沙利铂累积性外周神经毒性随机平行对照研究

[目的]观察荣筋方联合谷胱甘肽防治结直肠癌奥沙利铂累积性外周神经毒性疗效。[方法]使用随机平行对照方法,将60例住院患者按随机数字表法分为两组,每组30例。治疗期间避免饮食冷物、呼吸较冷空气、接触冷物体及金属等,防止诱发或加重神经毒性症状。均采用FOLFOX4化疗方案,化疗6周期(奥沙利铂85mg/(m2·d),静滴2h,d1;亚叶酸钙200mg/(m2·d),静滴2h,d 1、2;氟尿嘧啶400mg/(m2·d),静推d 1、2,600mg/(m2·d),静滴持续22h,d 1、2。每2周重复1次,2次为1周期)。对照组谷胱甘肽1500mg/m2,静滴,1次/d。治疗组荣筋方(炙黄芪30g,桂枝、白芍各15g,鸡血藤20g,白术、川芎、当归各15g,细辛3g,醋延胡索10g,全蝎3g,醋青皮、木瓜、怀牛膝各15g,甘草3g),水煎200mL,早晚口服,1剂/d,每次化疗结束后2天开始,连续5剂。若消化道反应明显,延至反应减轻再开始服用;谷胱甘肽使用同对照组。连续治疗24周为1疗程。观测慢性神经毒性分级、不良反应。治疗1疗程,判定疗效。[结果]治疗组Ⅰ级10例,Ⅱ级15例,Ⅲ级5例。对照组Ⅰ级3例,Ⅱ级16例,Ⅲ级11例。奥沙利铂化疗后神经毒性治疗组低于对照组(P<0.05)。[结论]荣筋方联合谷胱甘肽防治结直肠癌奥沙利铂累积性外周神经毒性,疗效满意。

荣筋拈痛方含药血清对骨关节炎大鼠SDF-1/CXCR4信号通路的影响

目的观察荣筋拈痛方对骨关节炎(OA)大鼠SDF-1/CXCR4信号通路相关调节因子的影响,探讨荣筋拈痛方治疗OA的作用机制。方法采用4%木瓜蛋白酶注射关节腔复制大鼠OA模型,Ⅱ型胶原酶消化法获取正常滑膜细胞与OA滑膜细胞,正常滑膜细胞即空白组,OA滑膜细胞分为模型组和治疗组。空白组和模型组细胞用10%空白血清培养,治疗组用10%荣筋拈痛方含药血清培养;各组干预24 h后,采用ELISA法检测滑膜细胞上清液中SDF-1含量,Real-time PCR和Western blot法检测滑膜细胞SDF-1 mRNA和蛋白表达。收集的滑膜细胞上清液干预退变软骨细胞24 h后,Real-time PCR和Western blot法检测退变软骨细胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠滑膜细胞上清液中SDF-1含量明显增加(P<0.05),大鼠滑膜细胞SDF-1 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05),退变软骨细胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组比较,治疗组大鼠滑膜细胞上清液中SDF-1含量明显减少(P<0.05),大鼠滑膜细胞SDF-1 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05),退变软骨细胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论荣筋拈痛方可通过调控SDF-1/CXCR4信号通路,抑制OA炎症反应,起到治疗OA作用。

荣筋拈痛方对白细胞介素-1β诱导的体外大鼠软骨细胞自噬相关基因表达的影响

目的:观察荣筋拈痛方对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的体外大鼠软骨细胞自噬相关基因表达的影响,探讨其防治膝骨关节炎的作用机制。方法:取4周龄SD大鼠膝关节软骨,进行软骨细胞的体外分离培养,选取第2代软骨细胞甲苯胺蓝染色进行细胞鉴定。经IL-1β 10 ng·mL^(-1)诱导建立体外软骨细胞炎症模型,诱导成功后,给予荣筋拈痛方(50,100,200 μg·mL^(-1))孵育48 h。将细胞分为空白对照组,模型对照组,荣筋拈痛方低、中、高剂量组。分别采用CCK-8法检测荣筋拈痛方对软骨细胞活性的影响,qPCR法检测软骨细胞中LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA表达,Western Blot法观察自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin 1的蛋白表达水平。结果:与模型对照组比较,荣筋拈痛方低、中、高剂量组均显著提高细胞活力,呈剂量依赖性增加(P < 0.01);模型对照组较空白对照组LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表达水平升高(P < 0.05);经100 μg·mL^(-1)荣筋拈痛方干预后LC3Ⅱ、Beclin 1的mRNA及LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的蛋白表达水平降低(P < 0.05)。结论:荣筋拈痛方可能通过抑制自噬水平,从而具有延缓膝骨关节炎退变的作用。

从化学空间探讨荣筋拈痛方补肝肾强筋骨和祛风湿止痹痛的作用

目的:从化学空间探讨荣筋拈痛方补肝肾强筋骨和祛风湿止痹痛的作用。方法:将荣筋拈痛方分为补肝肾强筋骨药组和祛风湿止痹痛药组,建立其化合物的分子数据集;搜索Drug Bank数据库中骨关节炎治疗相关的刺激关节软骨中蛋白多糖合成以及抗炎镇痛药物,建立其各自的药物分子集。依托定量构效关系平台,分析补肝肾强筋骨药组和刺激关节软骨中蛋白多糖合成药物分子数据集、祛风湿止痹痛药组和抗炎镇痛药物分子数据集的化学空间。结果:荣筋拈痛方分子具有分散的化学空间,且补肝肾强筋骨药物部分化合物与刺激关节软骨中蛋白多糖合成的药物具有相同或相近的化学空间,祛风湿止痹痛药物部分化合物与抗炎镇痛的药物具有相同或相近的化学空间。结论:荣筋拈痛方治疗骨关节炎具有广谱的作用特点,其中,补肝肾强筋骨药物可能具有刺激关节软骨中蛋白多糖合成的作用,而祛风湿止痹痛药物可能具有抗炎镇痛的作用。