RsICE1基因表达和转基因水稻抗冷通路研究

以萝卜幼苗和水稻T1代转RsICE1基因(从抗寒萝卜植株中分离的一个编码碱性-螺旋-环-螺旋低温胁迫转录因子,HQ891287)株系为材料,通过半定量RT-PCR及实时定量PCR等方法,分析RsICE1基因的表达、水稻转基因株系中RsICE1基因的遗传及冷诱导基因的表达情况。结果显示:(1)半定量RT-PCR分析表明,RsICE1基因在萝卜的根、茎、叶中为组成型表达,在幼苗根和茎中表达量较强;RsICE1基因的表达水平能够被冷处理和NaCl处理诱导上调表达,但ABA和脱水处理无上调作用。(2)卡方测验表明,水稻转基因T1代潮霉素抗性发生了3∶1分离模式;Southern和Northern杂交结果表明,4个抗冷转基因株系中RsICE1基因均以单拷贝、单位点整合到水稻基因组并正常表达。(3)实时定量PCR分析表明,冷胁迫下,RsICE1基因超表达但对水稻OsDREB1A(AF300970)、OsDREB1B(AF300972)、OsDREB1F(AY785897)基因表达没有影响,表明RsICE1基因对转基因水稻抗寒性的影响不依赖OsDERB1冷反应通路。

萝卜低温胁迫转录因子的克隆及遗传转化

采用RT-PCR和电子克隆技术从抗寒植物萝卜(Raphanus sativusL.)中分离了一个低温胁迫转录因子的cDNA全长序列,命名为RsICE1(GenBank登录号为HQ891287).序列分析显示,该基因全长1 375 bp,编码区为1266 bp,编码421个氨基酸.序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其他植物的ICE1蛋白具有较高的同源性.进化树分析表明,RsICE1编码的蛋白与油菜的ICE1编码蛋白亲缘关系最近,处在同一进化分枝.半定量RT-PCR分析表明,RsICE1是冷诱导条件下差异表达的基因.构建该基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法转化粳稻品种龙粳24,经PCR和RT-PCR分子检测,证明RsICE1基因已经整合到水稻基因组中,并正常表达.与对照相比,低温处理后转基因株系存活率和脯氨酸含量明显增加,相对电导率积累速率明显下降,提高了抗低温胁迫能力.