骨质疏松性椎体压缩性骨折患者血清BMP-2,Runx2水平对术后骨折延迟愈合的预测价值

目的探讨骨质疏松性椎体压缩性骨折(Osteoporotic vertebral compressibility fracture,OVCF)患者血清骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、核心结合因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)水平对术后骨折延迟愈合的预测价值。方法选取2020年1月-2023年4月徐州医科大学附属淮安医院骨科收治的260例OVCF患者为研究对象,均采用经皮椎体成形术(Percutaneous vertebroplasty,PVP)或椎体后凸成形术(Percutanous kyphoplasty,PKP)治疗,根据术后3个月骨折愈合情况分延迟愈合组、正常愈合组。分析OVCF患者术后骨折延迟愈合的影响因素及血清BMP-2,Runx2水平对术后骨折延迟愈合的预测价值。绘制决策曲线和临床影响曲线,评价血清BMP-2,Runx2水平对术后骨折延迟愈合的价值。结果260例患者术后无失访,22例出现骨折延迟愈合,发生率为8.46%(22/260)。延迟愈合组年龄、吸烟比率、合并糖尿病比率、合并甲状腺疾病比率、有椎体裂隙征比率大于正常愈合组,骨密度T值、术前和术后3个月血清BMP-2,Runx2水平小于正常愈合组,差异有统计学意义(P<0.05)。合并糖尿病、有椎体裂隙征是OVCF患者术后骨折延迟愈合的独立危险因素,骨密度T值、BMP-2,Runx2是OVCF患者术后骨折延迟愈合的独立保护因素(P<0.05)。BMP-2,Runx2联合预测OVCF患者术后骨折延迟愈合对应AUC值为0.856。阈值在0.10~0.63范围内,BMP-2,Runx2联合评估模型评估OVCF患者术后骨折延迟愈合的净受益率优于单独检测。在阈值概率为0.26时,被该模型划分入高风险的人数与真阳性人数基本达成一致。结论OVCF患者血清BMP-2,Runx2水平降低,二者联合检测对术后骨折延迟愈合具有较高的预测效能。

RUNX2在宫颈鳞癌组织中的表达及其siRNA对Hela229细胞RUNX2表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨RUNX2蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达情况及RUNX2 siRNA对宫颈鳞癌Hela229细胞RUNX2基因表达、细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用免疫组化技术检测50例宫颈鳞癌、30例宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及30例正常宫颈黏膜组织中RUNX2蛋白的表达情况,并分析宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白表达与临床病理特征的关系。设计合成RUNX2 siRNA,通过脂质体将其转染至Hela229细胞,同时设立空白对照(不转染)和阴性对照(转染非特异性siRNA)细胞组。转染24、48、72 h后,采用MTT法检测各组细胞增殖,计算增殖抑制率;转染72 h后,采用RT-PCR及Western blot技术检测细胞中RUNX2 mRNA及蛋白的表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:宫颈鳞癌组织中RUNX2阳性表达率高于HSIL及正常宫颈组织(P<0.001);宫颈鳞癌组织中RUNX2蛋白的表达与肿瘤的临床分期有关(P=0.004)。与空白对照组和阴性对照组比较,RUNX2 siRNA组Hela229细胞增殖抑制率、RUNX2 mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论:RUNX2基因的高表达与宫颈鳞癌细胞的增殖关系密切。

钛合金微粒通过smad通路下调成骨细胞Runx2表达

目的探讨钛合金微粒(Ti-6Al-4V)对smad4、smad5、smad8影响,了解微粒对促骨形成信号通路影响。方法根据Ti-6Al-4V微粒浓度高低,将成骨细胞分为正常对照组(0μg/mL)、Ti-6Al-4V组(5、10、15μg/mL),采用RT-PCR和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测培养72h成骨细胞smad4、smad5、smad8 mRNA和蛋白表达。结果培养72h后,与对照组比较,smad 4、smad5、smad8 mRNA水平下降,差异有统计学意义(P<0.05),smad4 mRNA水平随Ti-6Al-4V微粒浓度增加呈抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05),smad4、smad5、smad8蛋白水平分别与其mRNA表达变化趋势一致。结论 Ti-6Al-4V微粒下调受体调节蛋白smad5、smad8和公用型蛋白Smad4表达,是Ti-6Al-4V微粒抑制核转录因子runx2表达关联因素之一。

富血小板纤维蛋白对人牙槽骨骨髓间充质干细胞中Runx2、miR-17及BMP2表达的影响

目的:比较雌激素(estrogen,EST)和富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)对人牙槽骨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中Runt家族相关转录因子2(runt-related transcription factor2,Runx2)、微小RNA17(microRNA,miR-17)及骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)表达的影响。方法:在临床拔牙过程中收集牙槽窝内的骨屑,经酶消化法体外分离培养得BMSCs,并于显微镜下观察细胞的生长形态。实验分为3组,雌激素(estrogen,EST)处理组(EST组,浓度10-8 mol/L)、富血小板纤维蛋白治疗组(PRF组)及对照组(DMEM完全培养基组)。3组细胞经培养后采用MTT法检测细胞增殖率,采用酶标仪检测碱性磷酸酶活性,RT-qPCR检测Runx2、miR-17表达水平,Western blot法检测BMP2表达水平。结果:3组细胞培养7 d后细胞数量、碱性磷酸酶活性达到最高水平,随后增殖速率逐渐减慢,其中PRF组、EST组细胞于第3天开始细胞增殖速率均显著高于对照组(P<0.05)。培养7 d后,PRF组、EST组BMP-2及Runx2蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。BMSCs培养7 d后miR-17水平显著降低,而Runx2水平显著增加,其中PRF组、EST组在培养7 d时表达水平显著优于对照组(P<0.05)。结论:雌激素、富血小板纤维蛋白均可有效促进人牙槽骨BMSCs中Runx2、miR-17及BMP2的表达,从而有利于BMSCs的增殖、分化。

DMP1、Runx2在小鼠下颌第一磨牙萌出过程中的免疫学定位

目的研究小鼠下颌第一磨牙萌出过程中牙本质基质蛋白1(DMP1)和Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达,并探索其表达与牙萌出之间的关系。方法分离出生后1 d至14 d小鼠的下颌骨,连续切片,偶氮卡红苯胺蓝染色显示磨牙萌出过程骨胶原形成情况,切片原位杂交法分析DMP1及RUNX2 mRNA在牙齿及周围组织的表达与分布,免疫组化法显示DMP1和RUNX2蛋白的表达与分布。结果冠方骨组织中骨胶原形成在P5 d出现高峰,以后呈逐渐减少的趋势;根方骨胶原形成在整个萌出过程中一直呈活跃状态,在P9 d出现高峰。DMP1表达越丰富,骨胶原形成越多,成骨活动越活跃。结论下颌第一磨牙萌出过程中,根方成骨活动一直很活跃,DMP1的表达与根方成骨活动参与了小鼠第一磨牙的萌出过程。

麦角甾苷促进大鼠骨折愈合及对骨形态发生蛋白/Runx2通路的影响

目的探讨麦角甾苷促进大鼠骨折愈合及对骨形态发生蛋白(BMP)/Runx2通路的影响。方法将72只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性组和麦角甾苷低、中、高剂量组,除对照组外,其余各组均制备大鼠胫骨骨折模型,造模后阳性组腹腔注射复方骨肽(5 mg/kg),麦角甾苷低、中、高剂量组腹腔注射麦角甾苷(20,40,80 mg/kg),对照组和模型组腹腔注射等量生理盐水。术后4,8周在各组大鼠中随机取6只进行X线摄片和骨生物力学检测,测定血清中碱性磷酸酶(ALP)和骨Gla蛋白(BGP)含量及骨痂组织中BMP、骨形态发生蛋白受体瘤基因(BMPRIB)、骨形态发生蛋白受体(BMPR)Ⅱ和Runx2 m RNA表达水平。结果给药4周后,阳性药组和麦角甾苷中、高剂量组大鼠骨折线完全消失,骨折应力和骨折碎力较模型组均明显上升,模型组骨折线模糊。给药8周后,阳性组和麦角甾苷各剂量组骨折完全愈合,骨折应力和骨折碎力恢复正常;模型组骨折线消失,骨痂减少。给药4周后,阳性组和麦角甾苷各剂量组ALP和BGP含量,BMP,BMPRIB,BMPRⅡ和Runx2 m RNA相对表达水平较模型组明显上升(P <0. 05);给药8周后,模型组、阳性组和麦角甾苷各剂量组ALP和BGP含量,BMP,BMPRIB,BMPRⅡ和Runx2 m RNA相对表达水平较对照组均明显下降(P <0. 05),但均仍明显高于模型组(P <0. 05);各麦角甾苷剂量组反应呈剂量依赖性。结论麦角甾苷具有明显促进骨折愈合作用,其机制可能与激活BMP/Runx2通路有关。

骨痿不同中医证型中血瘀与PPARγ、Runx2相关性研究

目的 探讨骨痿不同证型中血瘀与PPARγ、Runx2的相关性。方法 94例符合要求的患者经辨证后分组,于入院第二天采集晨起空腹外周静脉血,检测凝血酶原时间(prothrombin time, PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplatin time, APTT)、凝血酶时间(thrombin time, TT)、纤维蛋白原(fipinogen, Fbg)及D-二聚体(D-Dimer,D-D),留取并采用Western blot检测入院第三天行全髋关节置换术股骨颈髓腔开路的松质骨中PPARγ、Runx2的蛋白表达量。结果 共94例患者符合纳入标准,分别为39例肝肾阴虚型、30例脾肾阳虚型、25例气滞血瘀型。3种证型骨痿患者的血清PT、TT、Fbg水平相比,差异无统计学意义(P>0.05)。气滞血瘀型骨痿患者较肝肾阴虚型及脾肾阳虚型骨痿患者在血清APTT及D-D水平方面有较大差异,差异有统计学意义(P<0.05)。气滞血瘀型骨痿患者松质骨PPARγ表达较肝肾阴虚型及脾肾阳虚型骨痿患者具有较高水平,差异有统计学意义(P<0.05)。脾肾阳虚型及气滞血瘀型骨痿患者松质骨Runx2表达较肝肾阴虚型骨痿患者具有较高水平,差异有统计学意义(P<0.05)。气滞血瘀型骨痿患者较脾肾阳虚型骨痿患者在松质骨Runx2表达方面有较大差异,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 气滞血瘀型骨痿患者的PPARγ及Runx2蛋白水平相比其他两种证型患者的PPARγ及Runx2蛋白水平差异有统计学意义。

雷奈酸锶通过TGF-β_1/Smad通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad通路在雷奈酸锶(strontium ranelate,Sr)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法:在大鼠BMSCs向成骨细胞的诱导分化过程中,用Sr处理细胞,用Western blotting法检测磷酸化Smad2(phosphorylated Smad2,p-Smad2)和Runx2的表达。用TGF-β1特异性阻断剂SB431542或Smad2小干扰RNA(Smad2-siRNA)预处理BMSCs后加入Sr,再观察p-Smad2和Runx2表达的改变。应用试剂盒检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及钙结节水平。结果:在大鼠BMSCs向成骨细胞的诱导分化过程中,Sr可增加p-Smad2和Runx2的表达,Sr浓度为1 mmol/L、作用1 h时,p-Smad2表达最多;Sr浓度为1 mmol/L、作用5 d时,Runx2表达最多;用SB431542或Smad2-siRNA预处理BMSCs后再加入Sr,不仅可以抑制p-Smad2和Runx2的表达,且ALP活性与钙结节数量也受到明显的抑制。结论:Sr可通过TGF-β1/Smad通路促进大鼠BMSCs向成骨细胞分化。

Hedgehog/Gli1通路在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的：探讨Hedgehog/Gli1信号通路在雷奈酸锶（strontium ranelate,Sr）促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化中的作用。方法：体外分离培养大鼠BMSCs,诱导其成骨分化,根据实验目的加入不同浓度的Sr、Hedgehog受体拮抗剂cyclopamine（Cy）及Gli1小干扰RNA（Gli1-siRNA）。用Western blotting法检测Gli1及Runx2的表达,酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色法检测钙结节水平。结果：应用不同浓度的Sr（0.1-5 mmol/L）处理BMSCs细胞7 d后,细胞内Gli1蛋白表达增高,Sr的浓度为3 mmol/L时,Gli1表达达到高峰;使用Cy与Sr共处理BMSCs 7 d,能拮抗Sr对Gli1蛋白表达的上调作用;应用Gli1-siRNA转染细胞后,能下调Gli1蛋白的表达,并抑制Sr对Gli1下游Runx2蛋白表达的上调作用,还可拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论：Hedgehog/Gli1通路参与了Sr促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的过程。

不同氧浓度对骨髓基质细胞向成骨细胞分化的影响

目的:观察不同低氧环境对在向成骨细胞分化培养系中的骨髓基质细胞核心结合因子α1(Cbfα1/Runx2)、骨形态发生蛋白2(BMP2)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPAR-γ2)表达的影响,探讨低氧环境对成骨细胞分化的影响。方法:取4月龄雌性SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中培养传代后,随机分成4组,每组样本数为8,加入分化培养基,分别将细胞放入4个不同氧浓度中继续培养,3d后进行下面的实验:用Trizol提取细胞总RNA,用半定量逆转录PCR(RT-PCR)检测(Cbfα1/Runx2)、BMP2和PPARγ2mRNA的表达;用Western blotting检测(Cbfα1/Runx2)、BMP2蛋白的表达。结果:1.与常氧组(20%)相比,各低氧组Runx2mRNA和Runx2蛋白的表达明显增加。2.与常氧组(20%)相比,各低氧组BMP2mRNA的表达明显增加,低氧可促进BMP2蛋白的表达。3.与常氧组(20%)相比,各低氧组PPARγ2mRNA的表达明显降低。结论:低氧能明显促进Runx2mRNA、BMP2mRNA和Runx2蛋白的表达,且氧浓度越低,Runx2mRNA、BMP2mRNA和Runx2、BMP2蛋白表达越多,相反,低氧能明显抑制骨髓基质细胞PPARγ2mRNA的表达,且氧浓度越低,PPARγ2mRNA的表达越低,表明低氧明显抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化而促进其向成骨细胞分化。

Shh在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用

目的：研究SonicHedgehog（Shh）在雷奈酸锶（strontiumranelate，Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨细胞分化中的作用。方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化、培养大鼠BMSCs，取第3-5代BM．SCs加入成骨诱导液诱导成骨分化，再加入不同浓度sr及Shh拮抗剂cyclopamine（Cy），分别观察它们对BMSCs向成骨细胞分化的影响。酶标法检测成骨细胞分化早期标志物碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）的活性；茜素红染色检测细胞钙化水平；Westernblotting法检测Shh和Runx2蛋白的表达情况。结果：Sr（3mmol／L）可以使细胞ALP活性增高，钙结节形成增加。Sr（0．1-5mmol／L）作用BMSCs7d，可明显促进Shh和Runx2蛋白的表达，且Shh蛋白在1mmol／LSr作用时表达最多，而Runx2在3mmol／LSr作用时表达最多。1mmol／LSr作用BMSCs不同时间（1、3、5、7d），呈时间依赖性地上调Shh和Runx2蛋白的表达。cy（10Iμmol／L）不仅拮抗sr对Shh和Runx2表达的上调作用，还抑制sr对ALP和钙结节形成的促进作用。结论：sr可通过上调Shh蛋白及成骨特异性转录因子Runx2的表达促进BMSCs向成骨细胞分化。

锁骨颅骨发育不良家系致病基因突变及蛋白结构变化

目的检测一个锁骨颅骨发育不良综合征(CCD)家系RUNX2基因突变情况,分析突变体蛋白结构的变化。方法对家系患者进行X线片检查,抽取外周静脉血,提取基因组DNA,采用聚合酶链反应(PCR)扩增RUNX2基因并测序,对测序结果进行Blast分析。运用Swiss-Model软件预测,SWISS-Pdb、RasMol浏览器分析突变体蛋白构像。结果 CCD家系患者RUNX2基因编码序列在外显子3发生错义突变c.674G>T(p.R225L)。蛋白结构预测分析显示,突变体蛋白由于亲水性精氨酸为疏水性的亮氨酸所替代,引起分子内部分氢键基团丢失以及分子表面静电势能改变。结论 RUNX2基因c.674G>T(p.R225L)杂合突变是该家系发病的分子基础,氨基酸序列的改变对蛋白质的空间结构产生影响。

钙磷诱导大鼠血管平滑肌细胞钙化的机制研究

目的:探讨氧化应激损伤在钙磷诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化过程中的作用机制。方法:采用氯化钙(Ca Cl2)联合β-甘油磷酸钠(β-GP)建立大鼠VSMCs钙化模型。实验分为4组,对照组、钙化组、钙化+过氧化氢(H2O2)组和钙化+过氧化氢酶组。8天后分别通过茜素红S染色法和邻甲酚肽络合酮比色法检测各组细胞钙结节形成及钙含量;活性氧检测试剂盒(DCFH-DA探针)检测各组细胞活性氧阳性细胞数;蛋白免疫印迹法检测各组细胞中成骨转录因子Runx2的蛋白表达量。结果:钙化组活性氧的产生、钙结节、钙含量及Runx2蛋白表达量均显著高于对照组,钙化+过氧化氢组与钙化组相比,各项指标进一步升高,差异有统计学意义(P<0.05)。钙化+过氧化氢酶组活性氧产生量、钙结节、钙含量及Runx2蛋白表达量均低于钙化组和钙化+过氧化氢组,仍高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但其中Runx2蛋白表达量与对照组相比则差异无统计学意义(P>0.05)。结论:氯化钙联合β-GP通过激活ROS-Runx2信号通路诱导大鼠VSMCs钙化形成。

MAPKs信号通路在内皮素-1诱导的牙周膜干细胞成骨分化过程中的作用研究

目的:研究丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号通路在内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)诱导的牙周膜干细胞|(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化中的调控机制。方法:体外培养牙周膜干细胞,于ET-1处理前分别加入ERK通路抑制剂PD98059,JNK通路抑制剂SP600125,p38 a通路抑制剂SB203580.以未作任何处理的牙周膜干细胞为空白对照,以单独加入抑制剂的牙周膜干细胞为阴性对照,用100nM BT-1干预不同组牙周膜干细胞14d,通过实时定量PCR及Western blot技术检测细胞Runx2和0CN基因和蛋白的表达情况。结果:ET-1对牙周膜干细胞Runx2和0CN基因及蛋白表达具有显著促进作用,但PD98059抑制了ET-1对牙周膜干细胞Runx2和0CN表达的促进效应,而SP600125和SB203580的抑制作用不显著。结论:BT-1通过ERK信号通路调控牙周膜干细胞Runx2和0CN的表达。

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2的拮抗剂noggin及Smad1小干扰RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论 BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。

绝经后骨质疏松患者胎球蛋白-基质gla蛋白-钙磷矿化复合物的作用机制研究

目的探讨胎球蛋白-基质gla蛋白-钙磷矿化复合物（FMC）在绝经后骨质疏松症（PMOP）患者发病中的作用机制。方法分别选择PMOP患者（PMOP组）和骨量正常者（非骨质疏松组）各23名,采用双能X线吸收法（DEXA）测定腰椎骨密度（BMD）,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清胎球蛋白A（fetuin-A）、基质gla蛋白（matrix gla protein,MGP）、骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein,BMP2）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor-2,Run X2）水平,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测骨组织局部fetuin A、MGP、BMP2、Run X2mRNA表达。结果 PMOP组血清Fetuin-A、MGP、腰椎BMP2、Run X2 mRNA表达明显低于非骨质疏松组,而腰椎MGPmRNA表达高于非骨质疏松组（P〈0.05）;组间比较,血清BMP2、Run X2水平、腰椎Fetuin-A mRNA表达,均差异无统计学意义（P〉0.05）。多元逻辑回归分析显示,腰椎MGP、BMP2及Run X2 mRNA表达与BMD相关（OR 1.016,95%CI0.809~0.991,P=0.029;OR 1.230,95%CI 1.063~1.424,P=0.015;OR 1.107,95%CI 1.016~1.205,P=0.048）。结论血清FMC合成的减少及MGP在局部骨组织聚集,可能通过影响BMP2/Smad/Run X2信号通路,抑制正常的骨矿化,从而导致PMOP的发生。

人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因敲除促进小鼠动脉血管钙化的机制研究

目的研究人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)在小鼠动脉血管钙化形成过程中的作用。方法 1构建血管特异性PTEN敲除小鼠(PTEN△/△),对照组小鼠为PTENf/f;2免疫组化检测Apo E全敲除小鼠钙化血管中PTEN的表达水平;3体外通过钙化培养基诱导血管钙化;4Alizarin Red染色和Von Kossa染色评估PTEN敲除后小鼠血管钙化程度;5实时荧光定量PCR检测血管钙化标志物Runx2、骨钙蛋白和BMP2的表达水平。结果 1与普通饮食组相比,高脂饮食诱导的Apo E基因敲除小鼠血管钙化明显,而钙化后的血管中PTEN的表达水平显著下降(P<0.01);2经体外诱导后,PTEN△/△小鼠血管明显钙化,而PTENf/f小鼠血管几乎无钙化;3与PTENf/f组相比,PTEN△/△小鼠血管钙化标志物Runx2、骨钙蛋白和BMP2的表达均明显升高(P<0.05)。结论血管特异性PTEN基因敲除促进小鼠血管钙化的形成。

转化生长因子β1对大鼠髓核细胞凋亡影响的实验研究

目的 :探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠髓核细胞凋亡的影响以及其作用机制。方法:采用序贯酶消化法分离培养SD大鼠髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs),实验用第3代培养的NPCs,分为6组:A组,空白对照组,用DMEM培养基常规培养,不加任何处理;B组,用含有终浓度为20ng/ml肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)的DMEM培养基培养;C组,用含有终浓度为50ng/ml TNF-α的DMEM培养基培养;D组,用含有终浓度为100ng/ml TNF-α的DMEM培养基培养;E组,用同时含有终浓度为100ng/ml TNF-α和10ng/ml TGF-β1的DMEM培养基培养;F组,在E组培养基的基础上加TGF-β1/smad通路抑制剂SB431542(设置终浓度为10μmol/L)进行培养。培养12h后,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖活性,逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)检测各组细胞中基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinases 3,MMP3)、凋亡相关蛋白(bcl-2-associated x protein,Bax)、蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)m RNA相对表达量,Western blot检测各组细胞中MMP3、Bax、ACAN、CollagenⅡ、磷酸化的smad3蛋白(phosphorylate drosophila mothers against decapentaplegic protein 3,p-smad3)和Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)蛋白表达量。结果 :与A组相比,不同剂量的TNF-α(B^D组)均能够促进MMP3(B^D组依次为0.652+0.015、0.899+0.018、1.026+0.023)和Bax(B^D组依次为0.725+0.058、0.928+0.018和1.138+0.019)的表达,诱导髓核细胞的凋亡,并且呈现剂量依赖性关系。与D组相比,E组MMP3(0.568+0.015)和Bax(0.626+0.024)表达下调,ACAN(1.056+0.014)、CollagenⅡ(1.098+0.032)、p-smad3和Runx2表达量增高,差异有统计意义(P<0.05)。与E组相比,F组MMP3(1.015+0.015)和Bax(1.126+0.024)表达上调,ACAN(0.314+0.023)、CollagenⅡ(0.299+0.0.19)、p-smad3和Runx2表达量下降,差异有统计意义(P<0.05)。结论 :TGF-β1可能是通过激活smad/Runx2通路来拮抗TNF-α诱导的大鼠髓核细胞凋亡。

miR-34a对人脂肪间充质干细胞成骨向分化的调控

目的探讨miR-34a对人脂肪间充质干细胞(hASCs)成骨分化中相关蛋白的表达及相关作用机制。方法从西南医科大学附属医院接受选择性抽脂手术或其他腹部手术的捐赠者获得脂肪组织,并分离培养hASCs。分别使用miR-34a模拟物、抑制剂和阴性对照转染hASCs,并通过逆转录-聚合酶链反应检测miR-34a在hASCs成骨分化各时间点的表达,Western blot检测成骨细胞中RBP2、RNUX2、P27蛋白表达情况,用双荧光素酶报告基因测定系统测定海肾和萤火虫萤光素酶活性。结果与阴性对照组相比,在转染第0、4、8、12天,miR-34a模拟物组的细胞miR-34a表达水平显著升高(P<0.05),而miR-34a抑制剂组显著降低(P<0.05)。miR-34a模拟物组RBP2蛋白表达降低,而miR-34a抑制剂表达增加。双荧光素酶报告测定证实RBP2是miR-34a的直接靶标。此外,miR-34a模拟物组RUNX2和P27蛋白表达上调,而miR-34a抑制剂表达下调。结论 miR-34a在hASCs成骨分化中起促进作用,并可能通过靶向RBP2起作用。

雌激素通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号转导途径对钙诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响

目的研究雌激素对血管平滑肌细胞钙化的影响及机制。方法体外培养大鼠胸大动脉平滑肌细胞(A7r5),按CaCl2溶液不同时间和浓度梯度进行钙化模型建立。细胞随机分为正常对照组、钙化组、雌激素干预(钙化+雌激素)组、雌激素溶剂对照(钙化+Eth)组、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号转导通路拮抗剂干预(钙化+LY294002)组。对不同处理组细胞采用茜素红染色检测钙化结节,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞钙离子浓度及碱性磷酸酶(alkaline phospha⁃tase,ALP)活性;实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测Runx2的mRNA浓度,Western blot检测Runx2及磷酸化(phosphate,p)-Akt的表达水平。结果与正常对照组相比,钙化组A7r5细胞的茜素红染色钙化结节、钙离子浓度、ALP活性、Runx2的mRNA浓度和Runx2、P-Akt蛋白浓度明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。与钙化组A7r5细胞相比,雌激素干预后明显抑制A7r5细胞钙化(P<0.01),并降低Runx2、P-Akt蛋白浓度,差异有统计学意义(P<0.05)。结论雌激素可通过抑制A7r5细胞钙化过程中PI3K/Akt信号通路及下游的Runx2表达,从而抑制细胞钙化。