结核分枝杆菌甲硫腺苷核苷酶的原核表达及活性分析

目的克隆、表达、鉴定结核分枝杆菌（MTB）Rv0091基因编码蛋白，分析酶活性，初步鉴定其功能。方法构建Rv0091基因原核表达质粒，在大肠杆菌BL21trxB进行表达，经IPTG诱导，Ni2＋-NTA柱纯化后获得可溶性蛋白，通过SDS-PAGE分析目的蛋白纯度、Westernblot进行免疫学活性鉴定、质谱分析重组蛋白相对分子质量、酶耦联法检测酶活性，分析酶学性质。结果成功构建Rv0091基因原核表达质粒，建立了可溶性蛋白最佳表达体系，获得纯度在95％以上的可溶性蛋白，Westernblot结果证实重组蛋白为结核分枝杆菌蛋白，质谱鉴定其相对分子质量与理论值基本一致，酶学活性实验证实重组蛋白能够分解底物5’一甲硫腺苷（MTA），酶学性质分析表明最适缓冲液为磷酸盐缓冲液和Hepes，酶的热稳定性较差，37℃为最适反应温度，最适pH为10～12。结论初步证明该重组蛋白在体外能够分解MTA，发挥甲硫腺苷核苷酶（MTAN）的作用，可能在MTB的代谢中起关键作用。