结核分枝杆菌rBCG-Rv2029c重组疫苗的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌rBCG-Rv2029c重组疫苗并鉴定。方法通过PCR扩增Rv2029c抗原编码基因,然后用双酶切法将Rv2029c和pMV261质粒酶切,再将酶切产物连接成rpMV261-2029c重组质粒,用电穿孔法将该质粒导入BCG中构建成rBCG-Rv2029c重组疫苗,最后用SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的重组蛋白。结果通过PCR成功扩增出1 020bp的Rv2029c基因,插入到pMV261质粒中,再把融合基因成功导入BCG中,经双酶切及基因比对鉴定证实,再通过热诱导后用Western blotting显示重组蛋白具有免疫原性。结论成功构建了结核分枝杆菌rBCG-Rv2029c重组活疫苗,为重组疫苗的免疫机制研究奠定基础。

结核菌重组基因rBCG-Rv2029c的克隆表达及免疫原性分析

目的:用结核分枝杆菌特异性抗原Rv2029构建结核重组疫苗(BCG-Rv2029),在C57BL/6小鼠体内评估其免疫效应,并初步探讨其免疫机制。方法: PCR扩增基因Rv2029,构建重组质粒pMV261-Rv2029,转入卡介苗感受态细胞中,诱导表达并纯化Rv2029蛋白。以重组的rBCG-Rv2029c活疫苗为免疫原,皮下免疫C57BL/6小鼠,间接 ELISA方法检测小鼠血抗原特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度水平,XTT检测脾淋巴细胞抗原特异性增殖反应,流式细胞仪观察CD4 +T和CD8 +T细胞比例变化,IFN-γ、IL-2检测试剂盒检测细胞培养基中细胞因子表达水平。结果:成功构建重组疫苗BCG-Rv2029C,并诱导表达重组蛋白。经免疫小鼠后,重组卡介苗rBCG-Rv2029c能诱导较BCG更高的IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度水平,IgG2a/IgG1 的变化提示rBCG-Rv2029c可诱导Th1型免疫反应。与BCG相比,rBCG-Rv2029c可诱导产生更强的特异性细胞增殖反应、刺激产生更多的杀伤性CD8 + T细胞和CD4 + T细胞、能诱导产生更高水平的IFN-γ、IL-2细胞因子。结论:重组结核病疫苗rBCG-Rv2029c可诱导产生较BCG更强且针对休眠MTB的特异性体液免疫和细胞免疫,是一株值得深入研究的新型结核病疫苗。

结核分枝杆菌休眠存活调节子蛋白Rv2029c促进大肠埃希菌生长

目的探讨结核分枝杆菌休眠存活调节子(DosR)蛋白Rv2029c对大肠埃希菌生长的影响,以探索其生物学功能。方法根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列,设计Rv2029c特异性引物,采用原核表达的技术构建pET30a-Rv2029c重组质粒,并导入大肠埃希菌中进行表达。通过基因测序结果,确定正确质粒,将质粒负载大肠埃希菌,测定大肠埃希菌模式并绘制生长曲线。结果由于缺乏营养物质和氧气,空质粒组大肠埃希菌在6h进入平台期,而携带有pET30a-Rv2029c的重组质粒能够促进大肠埃希菌突破生长界限,维持快速对数生长期长达10h。结论结核DosR蛋白Rv2029c能够促进大肠埃希菌生长,突破其生长界限,提高细菌应对低氧、营养物质缺乏等应激环境的能力,这可能与其在低氧环境下促进细菌的糖酵解能力有关。

结核分枝杆菌Rv2029c蛋白抗原表位预测及氨基酸变异分析

目的预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白Rv2029c的B/T细胞抗原表位,分析抗原位点的氨基酸变异。方法 BLAST在线分析Rv2029c与人类蛋白同源性,利用DNAstar软件包中的Protean软件预测Rv2029c潜在B/T细胞抗原表位,通过BioEdit软件比对NCBI数据库中所有结核分枝杆菌复合群Rv2029c氨基酸序列,找出变异位点。结果 Rv2029c与人类蛋白同源性较低。预测该蛋白共含有12个潜在B细胞抗原表位,分别位于5-13、32-49、85-88、97-102、106-113、147-161、165-172、178-183、220-227、262-264、318-326、334-339位氨基酸;含有6个T细胞表位数,分别位于23-36、53-66、135-170、207-223、271-289、307-318位氨基酸。除136和221位氨基酸外,不同地区来源的结核杆菌分离株Rv2029c蛋白氨基酸序列较少发生变异。结论结核分枝杆菌Rv2029c是一个B细胞抗原表位占优势的蛋白抗原,T细胞表位略少,且氨基酸序列较为保守,可作为结核监测、治疗、预防的新靶点。

针对潜伏结核感染的A39 DNA疫苗构建及其免疫原性研究

选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAXI/Ag85A-Rv3425-Rv2029c(A39),并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应(PCR)扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1/Ag85A(A);PCR扩增Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1/Ag85A-Rv3425(A3);PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1/Ag85A-Rv3425-Rv2029c(A39)。将构建成功的重组质粒转入HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL/6小鼠,共分为5组:PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应[γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)高水平分泌],外周血CD4^+/CD8^+T细胞比值增加,CD8^+穿孔素^+T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。