结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的通过构建结核分枝杆菌(结核菌)CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His-Tag)镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果构建了含CFP-10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原,ELISA方法检测214份血清,阳性率达77.1%。结论目的基因克隆入宿主菌中并成功表达,重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。

结核分枝杆菌Rv2626c蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的构建结核分枝杆菌Rv2626c蛋白的重组表达载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中表达、纯化后研究Rv2626c重组蛋白的抗原性。方法将GenBank公布的结核分枝杆菌H37Rv株Rv2626c蛋白的氨基酸序列(登录号:CCP45424.1)按E.coli密码子偏好转换为对应的DNA序列,合成该DNA序列并克隆至pET24a(+)质粒上,构建pET24a(+)-Rv2626c重组质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中,以不同的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度、温度和时间条件下诱导表达Rv2626c蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western Blot)对Rv2626c重组蛋白进行鉴定。利用镍螯合亲和层析法纯化Rv2626c重组蛋白并将其免疫青紫蓝兔,制备抗Rv2626c抗血清,采用Western Blot和酶联免疫吸附法分别检测抗血清的特异性和效价。结果pET24a(+)-Rv2626c重组质粒构建成功。SDS-PAGE检测显示:转入该重组质粒的E.coli经IPTG诱导后表达Rv2626c重组蛋白,分子量约14500,大小与预期相符;Rv2626c重组蛋白的最佳诱导表达条件为31℃1.0 mmol/L IPTG诱导表达6 h,目的蛋白主要以可溶性形式存在,与Western Blot检测结果一致。Rv2626c重组蛋白免疫青紫蓝兔获得的高免血清特异性良好,经酶联免疫吸附法测定该血清效价为1∶256000。结论在E.coli中成功表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白,且纯化的Rv2626c重组蛋白具有较好的纯度和抗原活性,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。