结核分枝杆菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究

目的用结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）特异性抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂（incom-pleteFreund’s adjuvant，IFA）构建结核亚单位疫苗（Rv3400-IFA），在C57BL／6小鼠体内评估其免疫效应。体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264．7并评估其免疫应答。方法PCR扩增基因Rv3400，构建重组质粒pET28a（＋）-Rv3400，转人大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，诱导表达并纯化Rv3400蛋白。用抗原Rv3400、阳性对照脂多糖（1ipop01ysaccharides，LPS），分别刺激小鼠巨噬细胞RAw264．7，阴性对照为未刺激的巨噬细胞，流式细胞术检测细胞表面分子表达，收集细胞培养上清，ELISA检测细胞因子的分泌。另一方面纯化的Rv3400蛋白与IFA充分乳化构建亚单位疫苗免疫小鼠；C57BL／6小鼠采用数字表法随机分为3组，分别为实验组Rv3400组、阳性对照组Rv3425组、阴性对照组IFA组，每组5只，每2周1次、共免疫3次。分别采用酶联免疫斑点检测技术（enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT）和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估。结果（1）成功克隆表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400。（2）体外细胞实验结果显示：Rv3400抗原刺激巨噬细胞，其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCII表达量显著提高，阳性细胞比率[分别由未刺激的（34．70±2．40）％、（31．25±18．31）％、（41．80±6．01）％、（44．30±0．44）％提高至1μg/mlRv3400抗原刺激后的（90．45±7．71）％、（90．10±4．10）％、（89．97±7．79）％、（85．13±5．12）％]；能促进细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-a，TNF-a）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），分别达（49217．0±390．61）pg／ml、（1783．4±51．18）pg／ml。（3）免疫小鼠后，ELISPOT结果显示：实验组Rv3400组小鼠分泌INF-7的斑点形成细胞（spotformingcells，SFC）（136．20士95．09）显著高于阴性对照组（14．00±9．62）（t=2．859，P〈0．01）；ELISA结果显示：Rv3400组小鼠T细胞产生TNF-α和IFN-7的水平[（247．38±142．268）pg／ml、（325．45±75．19）pg／m1）]明显高于阴性对照组[（69．25±60．06）pg／ml、（2．22±1．28）pg／ml（t=2．579，PG0．05；t=8．597，PG0．01）]；（4）Rv3400组小鼠脾CD4’CD44№“、CIN’CD62Llow、CD8＋CD44high、CD8＋CD62Llow T淋巴细胞百分比[（44．20±11．95）％，（43．56±11．90）％，（48．88±7．42）％，（47．04±7．72）％]与对照组IFA组[（27．02±6．56）％，（62．60±4．73）％，（30．57±6．00）％，（58．48±6．06）％]相比，差异有统计学意义（one-wayANOVA，F=18．460，F=8．108，F=32．194；F=4．080；P〈0．05，P〈0．01，P〈0．01，P〈0．05），呈显著性增加。（5）通过间接ELISA测定免疫后的小鼠血清抗体IgG效价水平高达1：409600，表明抗原Rv3400也能诱导有效的体液免疫应答；IgG2b／IgGl水平为1．8，说明抗原Rv3400诱导小鼠以Thl型免疫反应为主。结论亚单位疫苗Rv3400-IFA在C57BL／6小鼠体内可产生较好的细胞免疫和体液免疫效应。结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400有望成为新的结核病疫苗设计及诊断的候选抗原。