融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

本研究通过融合表达Rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,Rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

Rv3872/CFP-10/ESAT-6融合蛋白的人工合成及表达

根据牛分枝杆菌AF2122/97基因组中Rv3872、CFP-1O和ESAT-6全长基因序列,以柔性linke(rG4S)3,将三基因序列进行串联,形成表达基因盒(Rv3872-CFP1O-ESAT6,RCE),人工合成并克隆于PUC57转移载体上(PUC57-RCE)。经EcoRI和HindIII双酶切PUC57-RCE,回收纯化RCE片段,与经过相同双酶切的pET-28a载体,于16℃水浴连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,重组质粒经培养鉴定,测序结果证实插入的REC片段序列编码和方向与预期一致。在优化的诱导条件下表达蛋白,分段收集样本,并各取少量进行SDS-PAGE,经Western-blot分析显示,融合蛋白RCE具有较好的免疫原性,与阳性牛血清在35kDa位置处有明显的反应带。

结核分枝杆菌毒力分泌基因Rv3872重组卡介苗的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv3872的原核重组表达质粒pET-3872并对其进行表达及鉴定。构建表达结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3872即PE35的重组卡介苗。方法:应用PCR技术扩增Rv3872基因,定向克隆入pET32a(+)并转化E.coli BL21(DE3)菌株,测序后用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测及鉴定。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。构建重组穿梭表达质粒pMV-3872,将重组质粒电穿孔进入卡介苗,对重组卡介苗进行诱导表达用SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定目的蛋白。结果:表达融合蛋白的pET-3872质粒构建成功,重组蛋白经Western blot检测出特异性阳性信号。重组卡介苗BCG-3872构建成功,热诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot,在培养上清中检测到目的蛋白。结论:成功构建了重组质粒pET32a(+),并在大肠杆菌中表达了PE35蛋白,有利于进一步研究Rv3872基因功能。本研究还对表达结核分枝杆菌蛋白PE35的重组卡介苗进行了鉴定,为进一步研究该重组卡介苗的免疫功能奠定了基础。

结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因的克隆及重组真核表达载体的构建

目的:克隆结核分枝杆菌Rv3872与Rv3873基因,并构建Rv3872与Rv3873基因的重组真核表达载体,为研究这2个基因的功能奠定实验基础。方法:利用PCR技术克隆Rv3872与Rv3873基因序列,将其连接至pMD-18T载体,鉴定成功后将Rv3872与Rv3873序列插入真核表达载体pEGFP-C1,构建重组pEGFP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体,并进行质粒PCR、双酶切以及测序验证。结果:经测序比对后,Rv3872与Rv3873序列与Gene Bank中公布的基因序列一致,重组载体构建成功。结论:成功构建重组pEG-FP-C1-Rv3872和pEGFP-C1-Rv3873真核表达载体。

结核分枝杆菌Rv3872抗原在结核病血清学诊断中的初步应用

目的探讨结核分枝杆菌Rv3872抗原在结核病血清学诊断中的价值。方法纯化Rv3872蛋白并作为抗原检测120例确诊的肺内结核病患者、119例确诊的肺外结核患者和127例卡介苗接种后的健康小儿体检者血清中的抗体水平。结果 Rv3872为抗原建立的ELISA检测方法可成功区分肺内结核、肺外结核和BCG接种的健康人群,其在肺内和肺外结核检测中的灵敏度分别为97.5%和95.0%,检测特异性为98.4%。结论 Rv3872应用于结核病血清学诊断具有极高的灵敏度和特异性,具有较高的应用价值。

新型重组卡介苗的免疫原性研究

结核病是一种慢性消耗性人畜共患病,不仅严重影响人类的身体健康,还对畜牧业造成惨重的经济损失。卡介苗是目前官方唯一认可使用的疫苗,但仅对儿童具有较好的保护力;部分国家也将卡介苗应用于动物结核病的预防中。但效果一般。本研究以小鼠为实验模型,对前期通过基因工程方法构建的增强型重组卡介苗GM-CSF-Ag85B-Rv3872-CFP10-ESAT6-BCG的免疫效果进行了评价,证实了该候选疫苗对小鼠的安全性,且能够产生针对BCG外源蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫,对结核病具有一定的保护作用。

不同佐剂组合对结核分枝杆菌四种蛋白的免疫原性影响

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)因其免疫记忆减弱,对于成人结核病的预防效果较差,通过使用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原构建结核亚单位疫苗可进一步增强免疫保护作用。本研究选用了MTB不同结构组分中的四种蛋白Rv0577、Rv2831、Rv3048c、Rv3872,并分别在原核表达体系中实现蛋白的可溶性表达,经亲和色谱纯化可得到高纯度的目的蛋白。以不同的佐剂组合与纯化的结核蛋白混合后免疫BALB/c小鼠,收集血清后用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测体液免疫效果。结果表明,以胞嘧啶—鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(cytosine phosphoguanine oligonucleotide,CpG)和铝(aluminiumhydroxide,Al)作为佐剂,能显著提高免疫原性较弱的Rv0577、Rv3048c和Rv3872的IgG效价,对免疫原性较强的Rv3872的抗体滴度无显著影响,并且佐剂的使用对小鼠体重无改变。这表明CpG和Al的联合应用可提高弱免疫原性结核蛋白的免疫应答且无明显毒副作用,可作为结核亚单位疫苗的一种有效佐剂配方。