Hepatitis B virus S gene mutants in infants infected despite immunoprophylaxis

Objective To assess the correlation between hepatitis B virus (HBV) surface gene mutant infection and hepatitis B (HB) vaccination failure Methods Using sera from 106 infants who were born to HBV carrier mothers and failed in HB immunoprophylaxis, HBV S gene was amplified by PCR, transferred to nylon membranes for Southern blots, and then hybridized with oligonucleotide probes Eleven of non hybridizing samples were used for DNA sequencing Results 93 4% (99/106) of the samples were HBV DNA positive, and 30 3% (30/99) failed to hybridize with at least one of the four probes DNA sequencing confirmed that 10 of the 11 samples had an S gene mutation with amino acid (aa) change The identified mutants included nucleotide (nt) 546T→A(aa131N→T), nt531T→C (aa126I→T), nt491A→C (aa113T→P), nt491T→A (aa113S→T), nt533C→A (aa127P→T), nt581T→A (aa143S→T), nt636A→T (aa161Y→F), and nt679A→C (aa175L→F) The sequence in one mother infant pair was completely the same, with mutations at aa131 and aa161 Conclusions The prevalence of HBV surface mutants is about 30% in the children failing in HB vaccination HBV mutants can infect infants by maternal infant transmission

乙型肝炎病毒S基因变异株的研究

目的 对７份ＨＢｓＡｇ诊断试剂检测结果不一致的样品进行确证并分析其原因。方法采用套式 ＰＣＲ法对７份样品进行ＤＮＡ扩增，并将阳性产物克隆到ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体上，然后进行测序并对其序列进行分析。 结果 ７份样品中６份为ＨＢＶ ＤＮＡ阳性，其中５份与Ａｂｏｏｔｔ和Ｏｒｔｈｒｏ ＨＢｓＡｇ试剂无反应或反应较弱，而且其ａ决定 簇的氨基酸均在１３４位发生改变，由Ｆ变为 Ａ；１份与 Ａｂｂｏｔｔ和Ｏｒｔｈｒｏ ＨＢｓＡｇ试剂反应较强，其ａ决定簇的氨基酸也 在１３４位发生改变，但由Ｆ变为Ｓ。结论 国内外首次报道ＨＢｓＡｇ ａ决定簇１３４位由 Ｆ变为 Ａ后，其抗原性明显降 低，不易被ＨＢｓＡｇ试剂检出；而１３４位由对变为 Ｓ后，其抗原性无明显改变。

单增李斯特菌溶血素S llsB基因缺失株的构建及部分生物学特性研究

为分析单增李斯特菌溶血素S(listeriolysin S,LLS)llsB基因缺失对单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)生物学特性的影响,本研究利用同源重组构建了llsB基因缺失株LM90-ΔllsB,并以8周龄、体重40g±5g的健康昆明系雄性小鼠为试验动物对其生长特性、半数致死量(LD50)、脏器载菌量等生物学特性进行了初步研究。结果显示,本研究成功构建了llsB基因缺失株;缺失株在体外连续培养20代过程中能稳定遗传。通过生长曲线测定发现,llsB基因缺失株生长活性略高于亲本株;小鼠感染试验结果显示,亲本株和缺失株的LD50分别为106.17和106.50 CFU;与亲本株相比,缺失株在小鼠肝脏和脾脏中的载菌量均极显著减少(P<0.01),说明缺失株对小鼠的感染能力明显减弱。在小鼠脑中未检出单增李斯特菌。综上所述,llsB基因对LM90的部分生物学特性可能有直接或间接的调控作用,本试验结果为进一步研究LLS的致病机理及防控李斯特菌病提供一定的理论依据。

E．coli核糖体蛋白质S12依赖链霉素突变抑制λN基因表达的分子机制

本文利用ＰＣＲ方法克隆了Ｅ．ｃｏｌｉＴ８３依赖链霉素（ｓｔｅｒｐｔｏｍｙｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，Ｓｍ＾ｄ）菌株中编码突变的核糖体蛋白质Ｓ１２的ｒｐｓＬ＾ｄ基因，并进行了ＤＮＡ序列分析，发现第４２位密码子由编码赖氨酸（Ｌｙｓ，Ｋ）的ＡＡＡ变为编码谷氨酰胺（Ｇｌｎ，Ｑ）的ＣＡＡ。依据Ｇａｒｎｉｅｒ原理预测了突变对Ｓ１２蛋白质二级结构形成趋势的影响，结果表明。

乙肝病毒S基因Pre-S区突变的人肝癌细胞HepG2稳定株构建及其生物学行为变化

目的构建稳定过表达乙肝病毒(HBV) S基因Pre-S区突变(Pre-S1缺失突变、Pre-S2缺失突变)的HepG2细胞株,并观察该突变对HepG2细胞生物学行为的影响。方法以NCBI中HBV JX661479. 1的Pre-S/S片段序列信息为模板,设计并确定Pre-S1突变、Pre-S2突变的核苷酸序列,采用全基因合成法获得目的片段并定向导入带有FLAG标签的p LVX慢病毒质粒载体(p Lenti-CMV-3FLAG-PGK-Puro),PCR、双酶切、Sanger测序技术检测重组质粒中目的片段的准确性。将HepG2细胞随机分为5组,空白对照组不处理,p LVX-vector组、野生型组、Pre-S1突变组、Pre-S2突变组分别感染p LVX-vector、p LVX-Pre-S/S、p LVX-Pre-S1 mut/S、p LVX-Pre-S2 mut/S慢病毒液;利用嘌呤霉素筛选HepG2稳定株,采用Western blotting法鉴定目的蛋白,分别采用克隆形成、细胞划痕试验观察HepG2细胞稳定株增殖、迁移能力。结果构建的p LVX-Pre-S/S、p LVX-Pre-S1 mut/S、p LVX-Pre-S2 mut/S重组表达质粒PCR电泳产物与理论值相符,经EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切后电泳产物与理论值相符; Sanger测序结果显示,p LVXPre-S1 mut/S、p LVX-Pre-S2 mut/S突变型除突变序列外,其他序列与HBV S基因野生型序列完全相同。空白对照组HepG2细胞全部死亡,其余组HepG2细胞部分存活。在野生型组、Pre-S1突变组、Pre-S2突变组43 k D分子量位置检测到目的条带表达,而p LVX-vector组无法检测到相应条带。与其他组比较,Pre-S2突变组HepG2的第14天克隆形成数增多、细胞相对迁移距离增大(P均<0. 05)。结论成功构建了HBV Pre-S/S基因野生型及Pre-S突变型的HepG2细胞稳定株,HBV的S基因Pre-S2缺失突变导致肝癌HepG2细胞增殖及迁移能力增强。

‘奥嗄二十世纪’梨自交亲和性分子机制及遗传特性研究

‘奥嗄二十世纪’是自交不亲和梨品种‘二十世纪’的自交亲和花柱突变体,花粉自交不亲和功能正常,其自交亲和性突变的分子机制及遗传特性目前仍有争议。本研究中通过田间自花及相互授粉以及基因组、mRNA转录和蛋白质水平比较,分析‘奥嗄二十世纪’、‘二十世纪’及其后代S-RNase基因的存在与否、表达特性及其在后代中的遗传。结果显示,‘奥嗄二十世纪’花柱S2-RNase基因的核苷酸序列和表达特性与其原始品种‘二十世纪’完全一致;而S4-RNase基因信号比其原始品种‘二十世纪’弱,在花柱中正常表达(包括转录和翻译水平),但表达量低;在‘奥嗄二十世纪’的自交亲和后代基因组中检测不到S4-RNase基因。本研究表明,‘奥嗄二十世纪’基因组中存在花柱S4-RNase基因,但不能遗传给后代。

鼠伤寒沙门菌rmlD缺失株的构建及生物学特性分析

为了研究rml D缺失对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)生物学特性及毒力的影响,利用自杀质粒介导的同源重组技术,构建了rml D缺失株S100Δrml D,并对其生物特性进行了鉴定。结果显示,rml D的缺失不影响鼠伤寒沙门氏菌的生长特性及对多黏菌素B、胆酸盐的敏感性,但黏附和入侵人肠黏膜细胞INT407能力显著增加。同时,rml D缺失株毒力比野生株降低了约2000倍。以上结果表明,rml D的缺失不影响鼠伤寒沙门氏菌的体外生长及对宿主抗菌活性物质的敏感性,但能显著降低菌株毒力。因此,rml D的缺失可以作为一条有效的减毒途径。

乙型肝炎表面抗原疑难判定血清的研究

用中国药品生物制品检定所检定合格的国内外HBsAgEIA试剂及ABBOTT抗 HBs、抗 HBcEIA试剂 ,对所收集的 13份HBsAg疑难判定血清进行检测 ,并用PCR方法检测血清中HBVDNA ,结果显示国内外HBsAg试剂对部分HBVDNA阳性样品的检出率差异较大 ,提示这些样品可能为S基因突变株或HBsAg含量较低 ,因此 ,HBsAgEIA试剂的敏感度仍有待进一步提高 ,并应进一步研制检测S基因突变株的HBsAg诊断试剂。

空间诱变创造克服籼粳杂种半不育性新种质和新恢源研究

利用高空气球搭载 ,使 2个对胞质雄性不育育性保持的粳稻品种“中作 59”和“海香”干种子处于海拔高度 3 0～ 3 5Km的高宽 8h后回收种植 ,从 SP2 代群体中 ,获得二类突变体 :一类为粳型亲籼并对胞质雄性不育具恢复能力的突变体 ,其突变频率依次为 8× 1 0 -3 和 6× 1 0 -3 。这类突变体的后代稳定株系与典型籼稻品种杂交 F1的结实率在 70 %以上 ,但与典型粳稻品种杂交 F1的结实率只有 3 0 %左右 ,与籼、粳不育系交配 F1的结实率也是如此。另一类为亲籼、粳并对胞质雄性不育具恢复能力的突变体 ,其突变频率依次为 3× 1 0 -3 和2× 1 0 -3 。这类突变体的后代稳定株系与典型籼、粳品种杂交 F1结实率均在 70 %以上 ,与籼、粳不育系测定 F1的结实率也是如此。从这二类突变体后代选出的生育期不同、综合农艺性状和米质均好的粳型亲籼恢复系和亲籼、粳恢复系 ,经 3年 6季与多个籼型不育系测交 F1,不仅表现出明显的籼粳杂种优势 ,而且结实率达 80～ 90 % ,籽粒充实度良好 ,千粒重在 2 3～ 3 2 g之间。本项研究结果表明 ,利用空间诱变创造新恢源和改变粳稻亲和性 ,克服籼粳杂种 F1的不孕性和籽粒充实度差的难题 ,是一条可行的新途径。

十字花科黑腐病菌中假定糖基水解酶基因与致病力相关研究

【目的】已报道的十字花科黑腐病菌Xcc 8004菌株基因组中XC1077被注释编码一个假定糖基水解酶,初步研究XC1077基因的致病性,为深入研究Xcc 8004中的糖基水解酶在植物病原菌侵染及定殖过程中的作用奠定基础。【方法】通过同源单交换构建XC1077整合突变体NK1077,用带有全长XC1077基因序列的p LAFRJ质粒对NK1077进行功能互补并检测致病性。【结果】PCR及酶切验证表明整合突变体NK1077和互补菌株C1077构建成功。在MMX基本培养基上,NK1077及C1077的生长情况与Xcc 8004一致。致病性试验结果表明,NK1077在满身红萝卜的致病性下降到Xcc 8004的48.3%,过敏反应(HR)检测结果表明NK1077在辣椒ECW-10R上产生的HR反应明显滞后,而互补菌致病力及过敏反应能恢复至野生型水平。【结论】XC1077基因在Xcc 8004中是一个与致病相关的基因。

透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。

猪流行性腹泻病毒山东分离株SD-2016的S基因序列分析

为研究本实验室分离的SD-2016分离株S基因序列特点,设计扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）S基因的2对引物,将扩增出的目的片段与克隆载体连接后测序,利用分子生物学软件对目的基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比对分析。结果：SD-2016毒株与CV777、LZC等GI群的毒株在核苷酸序列同源性比对结果为93.8%~95.0%,氨基酸序列同源性比对结果在92.5%~94.1%。绘制系统发育进化树发现,SD-2016株与中国广东分离株GD12、湖南分离株HUN在一个分支上,亲缘关系较近。对S基因的中和表位进行分析发现主要的氨基酸位点突变集中于抗原表位区COE区域（第499-638位氨基酸）和SS6（第764-771位氨基酸）,分别有6个位点和2个位点的突变。通过对SD-2016分离株S基因的分析,为以后猪流行性腹泻病的基因工程疫苗研制提供参考。

纹状体内注射AAV9-82Q诱导亨廷顿病小鼠模型构建及评价

目的通过向纹状体内注射携带82个CAG重复序列的腺相关病毒(AAV)载体9型(AAV9-82Q)构建亨廷顿病(HD)小鼠模型并对其进行评价。方法将50只C57BL/6小鼠随机分入AAV9-82Q组(n=19,注射AAV9-82Q)、AAV9-GFP组(n=19,注射空白对照病毒AAV9-GFP)及正常组(n=12,不做任何处理)。造模后采用转棒实验和平衡木实验评估小鼠的运动功能,Y迷宫实验评估认知功能,免疫荧光染色检测纹状体mHtt和NeuN表达。结果从造模后4周开始,AAV9-82Q组小鼠从转棒上掉落的平均潜伏期短于正常组、AAV9-GFP组,差异有统计学意义(P<0.05)。在造模后18~24周,AAV9-82Q组小鼠通过平衡木的时间长于正常组、AAV9-GFP组,差异有统计学意义(P<0.05)。3组小鼠的自发交替转换率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。AAV9-82Q组小鼠纹状体内可见明显的mHtt表达,但在正常组、AAV9-GFP组中未检测到mHtt;与正常组、AAV9-GFP组比较,AAV9-82Q组小鼠纹状体内NeuN表达未见明显减少。结论AAV9-82Q注射使小鼠出现运动障碍,纹状体过表达mHtt,成功构建HD小鼠模型。

鸡白痢沙门氏菌生物被膜形成相关基因rpoE的鉴定

【目的】通过鸡白痢沙门氏菌基因表达和缺失株生物特性的测定,鉴定其生物被膜形成的相关σ因子。【方法】利用结晶紫染色定量法测定沙门氏菌生物被膜形成能力;通过触酶试验测定rpo S活性,确定rpo S基因依赖性和非依赖性生物被膜形成株;利用建立的荧光定量PCR方法比较rpo S基因非依赖株在指数期和生物被膜形成期6个σ因子的基因表达差异;运用Red同源重组系统构建所鉴定σ因子基因缺失株,并测定野生株和基因缺失株对于环境应激的抵抗力差异。【结果】鸡白痢沙门氏菌S6702能够形成生物被膜,触酶试验阴性,确定S6702为rpo S基因非依赖性生物被膜形成株;荧光定量PCR检测显示,培养4-24 h后S6702中rpo E基因表达量最高;与野生株相比,Δrpo S缺失株保留了生物被膜形成能力,而Δrpo E缺失株不能形成生物被膜。rpo S和rpo E基因缺失株对于环境应激的抵抗力均显著降低。【结论】在rpo S基因非依赖性生物被膜形成株中,rpo E基因为参与生物被膜形成调控的σ因子之一,这一发现可用于进一步研究沙门氏菌生物被膜形成的调控机制。