单链尿激酶型纤溶酶原激活剂Kringle结构域催化功能探讨

Kringle(K)结构域广泛存在于与凝血和纤溶相关的各种因子中 .虽然 K结构域在一级结构上是一种比较保守的结构域 (与其他结构域相比 ) ,但是 K结构域的功能在各种因子中的作用有很大的区别 .为探讨单链尿激酶型纤溶酶原激活剂 (scu- PA)的 K结构域功能 ,构建了在 scu- PA的 K结构域的 1 1 8位 Gly与 1 1 9位 Leu之间插入 PRGDWR序列的突变体 (称为 insert mutant B,In B) ,并测定了野生型 scu- PA与 In B的纤溶相关反应的动力学常数 . scu- PA与 In B水解 S- 2 4 4 4反应的 Km 值无明显变化 (分别为 60 .4与 56.8μmol·L-1) ,而 In B的 kcat值 (0 .33s-1)比 scu- PA的 kcat值 (7.31 s-1)降低很多 ;In B激活纤溶酶原反应的 Km 值 (0 .397μmol· L-1)比 scu- PA Km 值(0 .648μmol·L-1)降低 40 % ,但 kcat值 (0 .0 1 65s-1)比 scu- PA的 kcat值 (0 .0 62 6s-1)降低 74% .以上结果说明 :K结构域主要与反应活性相关 ,而与酶及底物的亲和性无关 .

发色底物法定量测定重组u-PA产品的总活性和单链比例

目的 :建立一种发色底物酶水解方法定量分析重组尿激酶型纤溶酶原激活剂 (u_PA)中的总活性及其单链酶原比例。方法 :用嗜热菌蛋白酶激活u_PA转化成具有催化活性的双链尿激酶 ,再用尿激酶的发色底物S_2 44 4测定u_PA的总活性。在非激活条件下 ,u_PA产品中的单链酶原不会催化水解S_2 44 4底物 ,因而可以测定其单链酶原比例。结果 :优化了嗜热菌蛋白酶激活u_PA的反应条件和尿激酶催化水解S_2 44 4的反应条件。用这种方法测定了用CHO细胞表达的基因重组u_PA产品 ,单链比例大于 98%,比活性约为 11× 10 4 U/mg。结论 :用发色底物法测定重组人u_PA产品中的总活性和单链比例具有很好的重复性和准确性。