S100A9基因敲除对姥鲛烷诱导小鼠狼疮肾炎的影响

目的:探究S100A9基因敲除(S100A9^(-/-))对小鼠狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)的影响,阐明S100A9在LN中的作用。方法:6~8周龄雌性野生型及S100A9^(-/-)C57BL/6(B6)小鼠各10只;5只野生型B6和5只S100A9^(-/-)B6小鼠一次性腹腔注射0.5 mL姥鲛烷;另外5只野生型B6和5只S100A9^(-/-)B6小鼠一次性腹腔注射0.5 mL生理盐水。6个月后处死小鼠;ELISA法检测血清中抗双链DNA(double-stranded DNA,ds-DNA)抗体水平;测定血清肌酐、血清尿素氮、尿蛋白水平;留取肾组织进行HE染色,观察肾脏病理。结果:与野生型B6小鼠相比,S100A9^(-/-)B6小鼠体重、脾脏重量、肾脏结构、血清肌酐水平等差异无统计学意义;与对照的B6小鼠相比,姥鲛烷诱导的B6小鼠脾脏重量、脾脏长度、血清肌酐、尿素氮、尿蛋白、抗ds-DNA抗体、IgG水平均明显增加,肾脏出现狼疮样改变(肾脏肾小球体积增大,肾小管上皮水肿、管腔狭窄);与对照S100A9^(-/-)B6小鼠相比,姥鲛烷诱导的S100A9^(-/-)B6小鼠脾脏重量、脾脏长度、血清肌酐、尿素氮、尿蛋白、抗ds-DNA抗体、IgG水平均明显增加,肾脏出现狼疮样改变。但是,与姥鲛烷诱导的野生型B6小鼠相比,姥鲛烷诱导的S100A9^(-/-)B6小鼠的狼疮样症状及以上血清学和尿液指标改变均明显减轻。结论:姥鲛烷可以使野生型B6小鼠和S100A9^(-/-)B6小鼠出现狼疮病变,但S100A9基因敲除小鼠病变程度较轻,提示该基因对狼疮小鼠的发病可能有促进作用。

S100A9真核表达载体pEGFP-N3-S100A9的构建及其对U251细胞生长的影响

目的构建S100A9真核表达载体pEGFP-N3-S100A9,观察其对胶质瘤细胞系U251内S100A9基因表达及细胞生长的影响。方法应用RT-PCR和DNA重组技术构建pEGFP-N3-S100A9融合蛋白表达载体,并用双酶切、测序进行鉴定,用脂质体转染胶质瘤细胞系U251细胞。荧光显微镜下动态观察U251细胞绿色荧光的变化;培养24 h后提取转染细胞的总RNA及总蛋白。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)观察其mRNA表达情况,Western blot检测其蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果酶切鉴定与S100A9全长基因长度一致(345 bp);测序证实重组质粒中含有一与GenBank上登录的S100A9基因(NM_002965)序列完全一致的片段,表明成功构建真核表达载体;荧光显微镜下转染U251细胞可见绿色荧光蛋白表达,12 h后逐渐增多,24～48 h达高峰,且稳定表达较长时间;24 h后通过qRT-PCR检测到mRNA表达,Western blot检测到14×103目的蛋白表达(P<0.05),其增殖能力明显增强(P<0.01),且引起细胞G1期减少,S期增加(P<0.05)。结论成功构建真核表达载体pEGFP-N3-S100A9,转染到U251细胞后能有效上调S100A9基因的mRNA及蛋白的表达、促进细胞增殖。

冠状动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞钙结合蛋白S100A8和S100A9基因表达的变化

目的:探讨外周血单个核细胞钙结合蛋白S100A8和S100A9基因表达水平与冠状动脉粥样硬化的关系。方法:稳定性心绞痛(CAD)组61例:经冠状动脉造影(CAG)发现左主干有≥50%狭窄,或在左前降支、左回旋支和右冠状动脉主支发现至少有一处病变狭窄≥75%;对照组53例:有胸痛症状或有异常心电图、异常超声心动图表现,但冠状动脉造影表现为冠状动脉管壁光滑、未见明显粥样硬化斑块的患者。CAG前获得空腹静脉血进行血常规和高敏C反应蛋白(hs-CRP)检测、提取总核糖核酸并合成互补脱氧核糖核酸用于实时定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)。结果:CAD组糖尿病比例(34.4%比15.1%,P=0.032)、合并闭塞性动脉硬化和(或)缺血性脑卒中病史比例(19.7%比0%,P=0.0006)以及hs-CRP水平[0.20比0.10,P=0.022]均高于对照组。CAD组淋巴细胞百分比低于对照组(27.2%比31.7%,P=0.019)。CAD组S100A8和S100A9基因表达水平均高于对照组[分别为0.92(0.83-1.03)比0.84(0.72-0.99),P=0.028;1.09(0.91-1.41)比0.92(0.65-1.25),P=0.009]。S100A8和S100A9基因表达水平与白细胞分类计数水平均不存在相关性(均P>0.05)。糖尿病患者和无糖尿病患者的S100A8和S100A9基因表达水平无统计学意义(均P>0.05)。S100A8和S100A9基因表达水平均与hs-CRP水平相关(分别为r=0.52,P=0.0000;r=0.62,P=0.0000)。结论:稳定性心绞痛患者的外周血单个核细胞S100A8和S100A9基因表达水平升高,提示其持续高表达与冠状动脉粥样硬化有关。

小鼠抗人S100A9单克隆抗体可变区基因克隆及其序列分析

目的克隆小鼠抗人S100A9单克隆抗体(mAb)可变区基因并对其序列进行分析。方法从分泌小鼠抗人S100A9mAb的杂交瘤细胞株(ⅡD4B10)中提取RNA,采用逆转录PCR扩增出轻链可变区基因VL和重链可变区基因VH,并对VL和VH进行克隆测序与BLAST同源性比较分析。结果小鼠抗人S100A9 mAb VL基因编码区291 bp,编码97个氨基酸,属于IGKV14-111*01家族;VH基因编码区324 bp,编码108个氨基酸,属于IGHV1-80*01家族。所获取的VH和VL序列有明显抗体可变区特征,具有骨架区和互补决定区。结论获得鼠抗人S100A9 mAb的重链和轻链可变区基因,为构建基因工程抗体奠定基础。

钙结合蛋白S100A9基因与口腔鳞癌相关性分析

目的:研究S100A9蛋白表达与口腔鳞癌分化、转移的关系。方法:采用免疫组化SP法检测35例口腔鳞状细胞癌患者口腔黏膜组织中S100A9的表达,并结合临床资料对S100A9基因差异性表达与口腔鳞癌病人临床病理参数进行相关性分析。结果:S100A9在口腔鳞癌中高表达与癌旁正常口腔黏膜组织比较具有显著性差异(P <0. 05)。S100A9的表达水平与淋巴结转移成正相关。S100A9蛋白与患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度及临床分期无关(P> 0. 05)。结论:S100A9基因表达和口腔鳞癌的发生发展、侵袭转移密切相关; S100A9可作为判定口腔鳞癌恶性程度及评价预后的重要指标,也可作为新的生物标志物及治疗口腔鳞癌浸润转移的潜在靶目标。

CRISPR/Cas9技术制备S100A9基因编辑小鼠及表型研究

S100钙结合蛋白A9 (S100 calcium binding protein A9, S100A9)参与多种炎症反应及肿瘤细胞的迁移和侵袭调控等生物学过程。本研究目的是利用CRISPR/Cas9技术构建S100A9基因编辑小鼠,为探讨该基因生物学功能提供动物模型。根据S100A9基因序列构建针对外显子2和3的单链小向导RNA(smallguideRNA,sgRNA),体外转录后,通过显微注射将Cas9mRNA和候选sgRNA混合物注射到小鼠受精卵中,体外培养获得早期胚胎并移植到代孕小鼠,所获F0小鼠经PCR鉴定和基因测序鉴定其基因型。F0小鼠进一步与野生型C57BL/6小鼠测交获得F1杂合子小鼠,再通过F1小鼠自交获得纯合子后代,并利用real-timePCR、Western blot及免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)等方法验证S100A9表达和分布情况;构建鸡卵清白蛋白(ovalbumin from chicken egg white, OVA)激发的过敏性哮喘模型,HE染色观察小鼠肺组织病理变化。结果显示,本方法成功敲除S100A9基因2、3外显子2 492 bp,并获得能稳定遗传的S100A9^(-/-)小鼠。S100A9基因在野生型小鼠的肺和脾脏中高表达,而在S100A9^(-/-)小鼠肺和脾脏中未检测到S100A9 mRNA和蛋白的表达;在表型方面,S100A9^(-/-)小鼠在生长、繁殖及发育方面未表现出明显的缺陷,但在OVA处理条件下,相较于野生型小鼠,S100A9^(-/-)小鼠肺部表现出明显加重的炎症表型,且支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中嗜酸性粒细胞的占比显著升高。以上结果表明,本研究成功构建了S100A9基因编辑小鼠新品系,并初步证实S100A9功能缺失加重哮喘小鼠气道炎症,为研究S100A9基因功能提供了新的小鼠模型。