弓形虫表面主要抗原1(SAG1)蛋白的原核表达与鉴定

为了实现弓形虫主要表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)蛋白在原核表达系统中的高效表达,试验根据GenBank中弓形虫SAG1基因序列(登录号为S76248.1)及大肠杆菌密码子偏好性对目的基因序列进行优化设计,以pET-32a(+)为表达载体构建重组表达质粒pET32a(+)-SAG1,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)对重组菌进行诱导,表达重组蛋白,通过优化诱导条件实现对重组蛋白的大量表达,使用NGC^(TM)层析纯化系统纯化重组蛋白,并分别以抗His标签单克隆抗体和犬弓形虫阳性血清作为一抗、羊抗鼠IgG-HRP和HRP-兔抗犬作为二抗对重组蛋白进行Western-blot鉴定。结果表明:重组表达质粒pET32a(+)-SAG1经双酶切分别在5 900 bp和1 020 bp处出现1条载体条带和1条目的基因条带,与预期结果相符;重组蛋白大小为55 ku且以包涵体的形式成功表达,当诱导条件为25℃、0.4 mmol/L IPTG诱导8 h时重组蛋白的表达量最高;纯化后的重组蛋白条带单一,纯度较高,3个样品质量浓度分别为0.409 5,0.368 5,0.451 9 mg/mL;表达的重组蛋白与抗His标签单克隆抗体和犬弓形虫阳性血清均能特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了弓形虫SAG1重组蛋白,纯化后的重组蛋白纯度和质量浓度较高,且具有良好的反应原性。

玛湖凹陷玛页1井风城组页岩油地质甜点优选

玛湖凹陷风城组属于具有物源多、岩性复杂、整体含油、甜点分散等特征的混积型碱湖沉积,为了对页岩油进行高效勘探和开发,需要对页岩油地质甜点优选。以高压压汞、岩石热解等实验结果为基础,对玛页1井风城组储集层及其页岩油可动性等进行评价,构建页岩油地质甜点优选模型,评价页岩油地质甜点垂向分布特征。结果表明:孔隙度、总有机碳含量、脆性矿物含量和游离烃含量与100倍总有机碳含量之差分别是评价风城组储集层储集性能、含油性、脆性和页岩油可动性的参数;利用4个参数构建页岩油地质甜点优选模型,玛页1井风城组一类、二类和三类页岩油地质甜点的页岩油甜点因子分别为大于0.2823、0.0111~0.2823和小于0.0111;玛页1井风城组一类页岩油地质甜点主要分布在风二段上部和风三段,岩性以泥岩和白云质泥岩为主。

玛湖凹陷风云1井陆相深层页岩气勘探突破及其油气地质意义

二叠系风城组是玛湖凹陷主力烃源岩和勘探层系,落实深层—超深层页岩油气潜力对玛湖凹陷勘探具有重要指导意义。基于风云1井风城组页岩气发现及前风城组油气勘探成果,系统分析该井的岩性发育特征、烃源岩成烃条件和储层条件,明确玛湖凹陷风城组页岩油气系统中页岩油、气分布序列特征及油气地质意义。研究表明,风云1井风城组岩性主要为盐岩、页岩与粉—细砂岩等;风城组烃源岩有机质丰度总体较低,其中风一段烃源岩最为发育,平均有机碳含量达1.06%;储层整体致密,孔隙度平均为4.65%,其中云质页岩和灰质砂岩储集性能较好。此外,随深度增大玛湖凹陷风城组具有完整的由页岩油、页岩油气到页岩气的演化规律。前风城组油气来源于超深层的另一油气系统,应是下一步勘探的重要领域之一。

准噶尔盆地盆1井西凹陷石炭系火山岩凝析气藏的发现与勘探启示

准噶尔盆地石炭系火山岩油气藏是油气勘探的重点领域之一。根据录测井资料、地球化学分析数据及岩石薄片鉴定资料,结合地球物理方法,厘清了准噶尔盆地盆1井西凹陷石炭系火山岩油气成藏的主控因素,总结出深层火山岩气藏富集规律,明确了有利勘探方向。研究结果表明:(1)准噶尔盆地盆1井西凹陷风城组烃源岩厚度为100~300 m,面积约为5 400 km2,整体进入生凝析油—干气阶段,生气强度大于20×108m3/km2,为凹陷提供了丰富的天然气源。(2)研究区石炭系火山岩岩性复杂,爆发作用形成的安山质火山角砾岩受到风化淋滤作用,可形成物性较好的风化壳型储层。石炭系—二叠系大型不整合面和广泛发育的深大断裂是重要的输导体系,二叠系上乌尔禾组泥岩作为区域盖层,为凝析气成藏提供了保存条件,油藏主要分布在高部位,气藏分布于低部位。(3)通过“两宽一高”(宽方位、宽频带、高密度)技术,提高地震成像精度,联合时-频电磁技术(TFEM),实现了石炭系火山岩的精细刻画,为深层油气藏的勘探提供了有力支撑。石西16井的重大突破,证实了盆1井西凹陷石炭系火山岩具有巨大的勘探潜力。

准噶尔盆地盆1井西凹陷及周缘石炭系—二叠系天然气成藏条件及勘探方向

近期,准噶尔盆地盆1井西凹陷周缘SX16、SX18等井在近源下组合石炭系—二叠系取得了天然气重大发现,认为其具有成为大型天然气区的前景。然而,针对研究区石炭系—二叠系天然气分布规律以及勘探有利区缺少系统的研究,制约了天然气成藏规律的认识和下一步勘探部署。为此,综合地震、测井、岩心、薄片和地球化学分析等多种资料,系统研究了烃源岩、储层、输导体系等天然气成藏条件,建立石炭系—二叠系三大含油层组的成藏模式,并对下一步的勘探方向进行分析。研究表明:(1)风城组和下乌尔禾组是最重要的两套优质烃源岩,厚度为80~200m,埋藏深度大于7000m,演化程度高,Ro大于1.72%,已经达到了规模生气阶段,具备形成大中型气田的气源条件。(2)3套规模储层为天然气高产提供了基础,石炭系以火山岩为主,发育高孔气孔状溢流相火山岩和爆发相火山角砾岩,经风化作用和裂缝改造物性好,最高孔隙度可达20%以上;风城组常规砂砾岩—非常规云质致密砂岩—非常规云质页岩有序分布,孔隙度平均小于8%,但分布面积超2600km^(2);凹陷区上乌尔禾组一段砂体叠置连片,可形成岩性圈闭群;(3)海西期深大断裂体系与不整合面相匹配形成了立体输导体系,有利于下组合天然气大面积成藏;(4)三大含油层系具有不同的成藏模式,石炭系为新生古储、源储大跨度对接成藏模式,风城组为源内非常规与常规并存成藏模式,上乌尔禾组为大型地层—岩性圈闭大面积成藏模式。分析认为,盆1井西凹陷及周缘石炭系—二叠系天然气成藏条件良好,天然气勘探潜力大,鼻隆带靠近烃源岩区一侧的石炭系构造气藏,风城组常规砂砾岩气藏和非常规致密气、页岩气,以及凹陷区上乌尔禾组一段是今后勘探的有利方向。

准噶尔盆地盆1井西凹陷及周缘深层二叠系超压形成机制及演化特征

为明确准噶尔盆地盆1井西凹陷及周缘深层二叠系超压形成机制及演化特征,基于钻井、测井、实测地层压力等资料,运用测井曲线组合分析法和交会图版法以及盆地模拟技术,对超压成因机制及演化特征进行分析,并定量表征目的层不同成因类型超压的贡献率。结果表明:①研究区深层二叠系不同岩性地层超压成因具有明显差异,其中风城组和下乌尔禾组烃源岩层超压成因主要为生烃和欠压实作用,其中生烃作用占主导;泥岩盖层超压成因主要为欠压实作用;而风城组和下乌尔禾组储层超压成因主要为超压传递和欠压实作用。②研究区风城组烃源岩生烃增压自早二叠世开始,现今达到最大,不同构造部位增压大小差别较小,烃源岩层超压主要分布于39.43~49.16MPa,但其贡献率具有明显差异,凸起区较大,而凹陷区较小;凸起区和凹陷区生烃增压对总超压贡献率分别为84.49%~94.41%和65%~67.3%,研究区下乌尔禾组烃源岩生烃增压大小与风城组具有相似的规律;欠压实作用对泥岩盖层超压的贡献率一般为100%。③研究区二叠系储层超压传递增压主要形成于晚侏罗世至早白垩世以及古近纪至今,其贡献率在不同凸起区存在明显差异,达巴松凸起和石西凸起分别为21.86%~23.35%和100%。厘清研究区深层、超深层超压的分布规律,可以为盆地新区的进一步开发提供依据。

刚地弓形虫SRS29C核酸疫苗的构建及SRS29C与SAG1联合免疫保护性的比较研究

为了探究刚地弓形虫表面蛋白(surface antigen,SAG)SRS29C基因和SRS29C、SAG1联合基因的核酸疫苗对小鼠急性感染弓形虫的免疫保护效果,试验利用PCR方法扩增了SRS29C基因片段并将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-SRS29C,并对该质粒进行酶切鉴定,同时用该质粒对HEK293T细胞进行转染,再用Western-blot方法检测目标蛋白在细胞中的表达情况;用重组质粒pEGFP-SRS29C和pEGFP-SAG1单独免疫或联合免疫小鼠,用ELISA法测定血清IgG水平,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪测定CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞百分比,ELISA试剂盒检测脾脏细胞因子的表达情况;进行小鼠体内攻虫试验,记录小鼠存活时间。结果表明:成功构建了重组质粒pEGFP-SRS29C,表达的蛋白质大小为66 ku;pEGFP-SRS29C组和联合免疫组与PBS组和空载体组相比血清IgG含量、脾淋巴细胞增殖率、CD4^(+)/CD8^(+)值均显著提高(P<0.05);pEGFP-SRS29C组和联合免疫组γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量明显提高;联合免疫组诱免疫球蛋白G(IgG)、IFN-γ和TNF-α含量均高于pEGFP-SRS29C组和pEGFP-SAG1组。PBS组和空载体组小鼠存活8~9 d;pEGFP-SRS29C组小鼠存活(18.10±1.37)d,pEGFP-SAG1组小鼠存活(21.20±0.97)d,联合免疫组小鼠存活(24.20±1.72)d,极显著长于PBS组和空载体组(P<0.01)。说明单独使用构建的弓形虫核酸疫苗pEGFP-SRS29C或与pEGFP-SAG1联合使用能够诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,增强小鼠抵抗弓形虫感染的能力,并且SRS29C作为保护性抗原与SAG1联合免疫的效果更好。

准噶尔盆地玛页1井风城组生物标志化合物及其对古环境和生烃生物的指示

新疆准噶尔盆地西北缘玛湖凹陷风城组是盆地内最重要的烃源岩之一,目前发现的周缘油田大多与这一套烃源岩有关。然而,玛湖凹陷风城组烃源岩的有机质大多被改造成无定形体,尤其是大量藻类原始生物结构都已被破坏而无法鉴定,导致其生烃生物尚不明确。生物标志化合物可以为探索风城组烃源岩生烃生物及古环境背景提供一定的指示信息。本研究选取玛湖凹陷西北缘第一口对风城组全取心的玛页1井岩心利用气相色谱–质谱(GC-MS)技术,通过对正构烷烃、类异戊二烯烃、藿烷及甾烷等进行分析,探索风城组沉积时期的生物组成及古环境特征。结果表明,玛页1井风城组烃源岩碳优势指数(CPI)与奇偶优势(OEP)均在1附近,不具有明显奇偶优势;Ts/(Ts+Tm)、C_(29)20S/(20S+20R)甾烷及重排甾烷/规则甾烷等指示的成熟度略有不同,但总体处于低成熟–成熟阶段;遭受了低–中等程度的生物降解,各层段生物降解程度差异不明显;姥鲛烷/植烷(Pr/Ph)值为0.44~0.82,呈现出明显的植烷优势;高伽马蜡烷丰度和Pr/n-C_(17)与Ph/n-C_(18)的关系,指示风城组沉积于具有明显水体分层且盐度较高的还原–强还原环境中。正构烷烃的碳数分布广,呈低碳数占优势的单峰型;三环萜烷丰富,藿烷以C_(29)和C_(30)为主,升藿烷呈C_(31)>C_(32)>C_(33)>C_(34)>C_(35)正常降序分布;C27~C_(29)规则甾烷呈现C_(28)和C_(29)占优势的特征;甾烷含量普遍高于藿烷含量;β-胡萝卜烷含量高,2-甲基藿烷指数低,说明生烃生物以耐盐藻类为主。

准噶尔盆地盆1井西凹陷侏罗系三工河组凝析气藏特征及成因机制

基于油气地球化学、试油结果与凝析气相态分析实验等资料,采用盆地模拟技术分析了准噶尔盆地盆1井西凹陷前哨井区侏罗系三工河组凝析气藏特征,并对凝析气藏的成藏过程与成因机制进行了详细研究。研究结果表明:①盆1井西凹陷侏罗系三工河组凝析气藏为构造-岩性油气藏,优质储层岩性主要为灰色细—中粒长石岩屑砂岩,孔隙度为2.70%~16.10%,平均为12.10%,渗透率为0.016~109.000 mD,平均为14.170 mD,属于中孔、低渗储层,与下伏的二叠系风城组和下乌尔禾组2套烃源岩形成了良好的储-盖组合。②研究区凝析油表现为低密度、低黏度、低凝固点和低含蜡量等特征,正构烷烃以低—中碳数为主,为下乌尔禾组烃源岩成熟—高成熟阶段的产物。③研究区凝析气藏天然气组分以烃类气为主,甲烷与乙烷碳同位素值分布集中,分别为-37.40‰~-36.84‰与-27.55‰~-26.54‰,为腐殖型烃源岩裂解气,来源于下乌尔禾组烃源岩。④研究区下乌尔禾组烃源岩于古近纪早期生成的凝析油气经过不断调整最终于新近纪早期充注形成凝析气藏,从成藏至现今储层流体组分未发生改变,油气藏相态类型也未发生改变,为原生型凝析气藏。

CO_(2)对东海盆地丽水凹陷丽水36-1气田成藏的影响

从宏观地质、微观地化相结合的角度对丽水西次凹丽水36-1气田进行精细解剖,揭示了丽水西次凹油气成藏规律。研究结果表明:(1)丽水西次凹灵峰组普遍发育超压,垂向上分为3个带:超压封闭箱、对流层、深部流体滞留层。(2)丽水西次凹垂向上明显的分层结构导致构造带油气充注具有三阶段,二者之间具有良好的对应关系:底部超压封闭箱和顶部滞留层范围内包裹体均一温度分布为正常充注现象,而在中部对流层均一温度表现出幕式充注的特征。(3)丽水36-1构造带具有超压封盖、异常热流体突破改造的成藏模式。早期油气被封盖在灵峰组超压带之下,后期由于幔源岩浆的剧烈活动,幔源CO_(2)携带原生油藏向上运移,在明月峰组区域盖层的作用下聚集成藏,形成现今的丽水36-1气田。

弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察

目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段,并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法利用NcoⅠ、HindⅢ双酶切,从本室建立的pET-30a(+)-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段,并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中,构建表达重组质粒pET-32a(+)-trSAG1。将重组质粒转入E.coliBL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni-NTA agarose纯化后, Western-blotting分析其免疫反应性。结果成功构建重组质粒pET-32a(+)-trSAG1 ,通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白,相对分子质量40 000,Western-blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性,ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段,表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别,有望成为一种有价值的诊断抗原。

弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1在大肠杆菌中表达的初步研究

目的 构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法 用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE及Western -Blot分析。结果 获得pET2 8-SAG1/ROP1重组表达载体 ;SDS -PAGE及Western -Blot印迹显示SAG1/ROP1复合基因表达蛋白产物分子量约为 6 6kD ,具有一定的免疫活性。结论 弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1可在大肠杆菌中表达 ,表达产物具有免疫活性。

弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究

目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组（每组14只），分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒，每2周免疫1次，共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价，以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周，每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子，观察生存时间。末次免疫后4周，采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素（IFN-r）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示，重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达，重组蛋白的相对分子质量（尬）分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1：320、1：160和1：2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高，末次免疫后2周，pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平（0．612±0．031）显著高于其他各组（P〈0．05）。攻击感染后，pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为（288±7）h，较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h（P〈0．05）。末次免疫后4周，pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[（908．52±6．31）pg／m1]显著高于其他各组（P〈0．05），各组的IL-4水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论与弓形虫单基因疫苗pcSAGl和pcROP5相比，复合基因疫苗pcSAGl-ROP5所诱导的抗弓形虫IgG抗体和IFN-1水平较高，攻击感染后存活时间延长。

弓形虫SAG1和GRA4基因的原核表达及其重组猫疱疹病毒Ⅰ型转移载体的构建

为构建表达弓形虫抗原的重组猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)转移载体,本研究以pBluesciptⅡ-SK(-)为骨架载体,分别插入FHV-1 TK基因的5'(2 000 bp)和3'(1 700 bp)同源臂、pCAGGs载体中含有启动子和终止信号的表达盒以及弓形虫RH株SAG1或GRA4基因,构建重组FHV-1的转移载体pBS-TK-SAG1和pBS-TK-GRA4。将其分别转染于293T细胞,通过原核细胞表达的截短SAG1和GRA4重组蛋白制备的鼠多克隆抗体进行western blot鉴定。结果显示,制备的弓形虫SAG1和GRA4多克隆抗体能够特异性识别重组表达和虫体表达的天然的SAG1和GRA4两种弓形虫蛋白,分子量一致,分别为35 ku和45 ku。本研究为表达弓形虫RH株SAG1和GRA4基因的猫重组疱疹病毒Ⅰ型载体疫苗的研制奠定了基础。

弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后，定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+），酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导表达, 对融合的表达产物进行纯化和复性，通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒，并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达，其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31.58%。经过简易的纯化和复性过程，该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达，重组抗原经纯化和复性后，能有效检测弓形虫的感染，可用于构建弓形虫病检测试剂盒。

弓形虫SAG1的高密度发酵表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程。方法利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、SephadexG-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Westernblotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓形虫抗体的敏感性与特异性。结果高密度发酵诱导4h后工程菌液的OD600达到20.21;平均每升发酵液可收获工程菌26.10g;目标蛋白的表达量占菌体蛋白的25.82%;经Ni-NTA、Ni-NTA联合SephadexG-75及Ni-NTA联合切胶纯化的rSAG1蛋白纯度分别为72.36%、98.54%和97.39%;Westernblotting结果显示联合纯化的rSAG1与弓形虫免疫兔血清呈单一反应条带,与正常兔血清未出现反应带;Ni-NTA联合Sephadex-G75纯化的rSAG1对25例感染小鼠血清和38例抗体阳性患者血清的检出率分别为96%和94.7%。结论利用高密度发酵技术高效表达、Ni-NTA联合SephadexG-75纯化的rSAG1具有较高纯度和良好的免疫反应性,该工艺可以用于rSAG1抗原的批量生产。

弓形虫SAG1成熟蛋白编码区基因在甲醇酵母中的初步表达

目的 分析弓形虫主要表膜蛋白SAG1在甲醇酵母高效表达系统表达的可行性。方法 在 5′端和3′端引物分别引入EcoRⅠ和SpeⅠ酶切位点 ,PCR扩增SAG1成熟肽编码区基因 ,定向克隆到甲醇酵母分泌型表达质粒pMETαA中 ,构建不带 6个组氨酸尾序列的重组质粒。重组质粒被PacⅠ酶切下表达盒 ,氯化锂化学法转化腺嘌呤营养缺陷型毕赤甲醇酵母株PMD11和PMD16 ,通过腺嘌呤营养缺陷型选择培养基YPD筛选酵母重组子 ,并利用MM/MD选择培养板分析外源基因表达盒整合到重组酵母染色体中的方式。筛选甲醇利用野生型的重组酵母 ,用甲醇诱导表达 ,并分析SAG1的表达水平 ,从中筛选高表达转化子。结果 获得了经非同源重组整合到酵母染色体上的能有效利用甲醇作为唯一碳源的PMD11和PMD16转化株。在甲醇诱导后第 3天 ,细胞裂解液SDS PAGE检测开始出现分子量与目的蛋白预测分子量相同的蛋白带 ,但PMD11重组株中的该蛋白随培养时间延长而减少 ,而PMD16重组株中的目的蛋白量未见减少。上清中有 4 0kDa和 2 7kDa的两种蛋白 ,后者的量大于前者 ,并与SAG1成熟肽的大小一致 ,PMD16株的表达量大于PMD11株 ,总蛋白量约 35 μg/ml。 结论 弓形虫SAG1基因可在甲醇酵母表达系统中表达 ,但PMD11宿主菌会降解外源蛋白 ,而缺失了蛋白酶的PMD16?

弓形虫RH株SAG1基因序列体外扩增及生物信息学分析

根据SAG1基因序列,自行设计一对寡核苷酸引物,利用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中成功扩增出编码SAG1抗原的基因片段,扩增出的基因片段大小与预期长度(1006bp)相符,结果经测序验证,并利用生物信息学方法对SAG1蛋白理化性质、结构和功能进行了预测.

弓形虫表面抗原SAG1 DNA疫苗的构建

目的 构建真核重组表达质粒 pVAX1-SAG1,并探讨其诱导的体液免疫应答。 方法 采用多聚酶链反应技术 ,从弓形虫RH株基因组DNA中扩增截短型的SAG1基因片断 ,并克隆至载体pMD18-T ,经菌落PCR鉴定和测序分析后 ,亚克隆至真核表达载体 pVAX1,构建重组真核表达质粒pVAX1-SAG1,并予菌落PCR和双酶切鉴定。以此为疫苗候选分子免疫小鼠 ,检测其诱导产生的抗体。结果 PCR扩增出SAG1基因的截短型片段 ,其大小约 780bp ;测序的阳性TA克隆除两处发生同义突变外 ,其余序列与原序列一致 ;TA克隆的插入片段被亚克隆到真核表达载体 pVAX1,构建了重组表达质粒pVAX1-SAG1;该质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。 结论 成功构建了弓形虫表面抗原SAG1的DNA疫苗。