白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化

目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。

肝片吸虫SAP-2蛋白的基因克隆、表达及其诊断潜力初步评估

【目的】为了研究肝片吸虫(Fh) SAP-2蛋白的反应原性及作为Fh血清学诊断抗原的潜力。【方法】本研究利用RT-PCR方法对Fh SAP-2基因进行扩增,将扩增产物克隆入p MD19-T载体后测序,对其进行分子特征分析;构建原核表达载体p ET-SAP-2,在E. coli BL21(DE3)中进行表达,通过SDS-PAGE和Western blot对表达的重组蛋白进行反应原性分析;以纯化的重组蛋白SAP-2(re SAP-2)为抗原,建立了检测Fh特异性抗体的间接ELISA,评估了SAP-2蛋白作为Fh血清学诊断抗原的潜力。【结果】Fh SAP-2基因全长306 bp,编码101个氨基酸。在线软件分析发现,SAP-2为疏水性、无跨膜区蛋白,信号肽位于第1～15个氨基酸之间。系统进化树分析表明,Fh SAP-2与曼氏裂体吸虫同源性最高,与其他寄生虫存在较大的差异。Western blot证实,re SAP-2蛋白可被Fh阳性血清特异性识别,有较强的反应原性。用re SAP-2蛋白建立了间接ELISA,对23份Fh阳性血清和10份阴性血清进行检测,结果证实re SAP-2蛋白有良好的特异性和敏感性。【结论】Fh SAP-2蛋白具有较强的反应原性,具有作为Fh血清学诊断抗原的潜力。