转录因子Stp1、Stp2在白念珠菌致病中的作用及其对SAP2的调控机制

Stp1和Stp2是响应细胞外氨基酸刺激而激活的两个同源转录因子(TFs),其中Stp1调节蛋白酶和寡肽通透酶的表达,Stp2调节氨基酸渗透。近年来研究发现,Stp1的水平影响SPS氨基酸感受通路和雷帕霉素结合蛋白TOR通路,也可以通过参与调控白念珠菌的氮源代谢,进而诱导细胞发生自噬,造成SAP2的高表达,增强白念珠菌的毒力。本文就转录因子Stp1和Stp2在白念珠菌致病中的研究现状进行综述,并分析转录因子Stp1和Stp2增强其毒力致病的机制,旨在为新一代抗真菌药物的研发提供新的见解。

结构动力弹塑性与倒塌分析(Ⅱ)——SAP2ABAQUS接口技术、开发与验证

开发并实现了由大型商业软件SAP2000导入ABAQUS有限元模型的接口程序——SAP2ABAQUS,明确交代了适用于隐式算法UMAT与显式算法VUMAT的inp数据格式并给出了相应注记。SAP2ABAQUS接口程序基于Microsoft VS2008平台并采用Visual C#语言开发而成,提出并设置界面为导航方式,可自由选择生成隐式或显式格式的inp数据文件,不仅直接可转换不同截面杆系构件、壳体、组以及约束等信息,而且可将材料纤维信息直接转化为inp文件,包括难于处理的适用于隐式和显式算法的的钢材纤维、剪力墙配筋率等。可转化型钢构件包括圆形钢管、箱形钢管、工字钢与角钢,混凝土构件包括钢筋混凝土、圆钢管混凝土、方钢管混凝土、I字型以及十字形型钢混凝土。采用SAP2ABAQUS接口程序,对几种典型形式的结构模型分别转化,对比转化前后的模型信息以及模态分析结果,进一步验证了开发SAP2ABAQUS的可行性与准确性。该项工作可极大提高ABAQUS前处理的工作效率和模型转化的准确性。

白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化

目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。

重组Sap2蛋白与DC联合免疫对系统性白假丝酵母菌感染小鼠的保护作用

目的研究重组白假丝酵母菌(Candida albicans)天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)蛋白与致敏树突状细胞(DC)联合免疫对系统性白假丝酵母菌感染小鼠的保护效果。方法 PCR克隆白假丝酵母菌Sap2,与pMD19-T-Sap2载体转化至DH5α,阳性质粒与pET32a构建表达载体,转化至BL21(DE3),诱导目的蛋白表达。将白假丝酵母菌孢子、菌丝混悬液致敏小鼠DC后,3组小鼠分别免疫接种重组蛋白与致敏DC、重组Sap2蛋白、致敏DC,每组接种3次。再造系统性白假丝酵母菌感染模型,观察小鼠生存期、肾病理切片、观察保护性。结果成功构建pET32a-Sap2原核表达载体,目的蛋白被诱导表达并收集纯化。DC、重组Sap2蛋白、重组Sap2蛋白与DC均能有效延长系统性白假丝酵母菌感染小鼠生存期、保护小鼠肾脏,其中重组蛋白与DC联合免疫较单一的DC或Sap2免疫效果更佳。结论重组Sap2蛋白联合DC是系统性白假丝酵母菌感染重组疫苗的较理想免疫组合。

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3.1/SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3.1/SAP2,为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA,以其为模板采用聚合酶链反应(PCR)法获取SAP2基因,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)myc-HisC和SAP2基因行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,琼脂糖凝胶纯化,连接酶切产物,转化TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同,并定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)myc-HisC,电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3.1(+)myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3.1/SAP2重组质粒,该质粒能直接激活抗原提呈细胞,可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。

重组白假丝酵母菌Sap2的免疫保护性研究

目的:构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)的原核表达载体并诱导表达目的蛋白,进行小鼠试验观察免疫保护效果。方法:PCR克隆白假丝酵母菌Sap2,与pMD19-T-Sap2载体转化至DH5α,对阳性pMD19-T-Sap2质粒和pET32a载体进行双酶切,构建pET32a-Sap2表达载体,转化至BL21(DE3),诱导目的蛋白表达、收集纯化。小鼠行3次免疫接种重组蛋白后,制造系统性白假丝酵母菌感染模型观察小鼠生存期、肾脏病理切片。结果:成功构建pET32a-Sap2原核表达载体,目的蛋白被表达。重组蛋白对小鼠系统性白假丝酵母菌有一定的保护性。结论:接种原核表达的重组白假丝酵母菌Sap2蛋白,能在一定程度上抵抗系统性白假丝酵母菌感染,这为研究Sap2的疫苗奠定基础。

白念珠菌MP65和SAP2蛋白原核表达质粒的构建与表达

目的构建以白念珠菌基因MP65和SAP2为目的基因的原核表达质粒,IPTG诱导其表达融合蛋白,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株获取MP65和SAP2基因,分别插入至原核表达载体pGEX-4T-2和pET32a中;将重组表达质粒转染感受态E.coliBL-21,经IPTG诱导表达、纯化后,SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR法克隆出全长为1 140 bp的MP65和1 197 bp的SAP2基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-MP65及pET32a-SAP2,可分别表达出66 KD左右的GST融合蛋白和His融合蛋白。结论成功获取了白念珠菌基因MP65和SAP2,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;两种蛋白均有免疫原性。

Sap2蛋白与树突状细胞对系统性白假丝酵母菌感染的免疫保护性

目的小鼠进行重组蛋白与树突状细胞(DC)联合免疫,观察其对系统性白假丝酵母菌免疫保护效果。方法原核表达并诱导表达白假丝酵母菌Sap2蛋白;将白假丝酵母菌孢子、菌丝混悬液致敏小鼠DC后,分5组小鼠行3次免疫接种重组蛋白及致敏DC、致敏DC、DC、Sap2、PBS,再造系统性白假丝酵母菌感染模型观察小鼠生存期、肾病理切片、肾负菌量、检测CD4+、CD8+百分率观察保护性。结果成功构建pET32a-Sap2原核表达载体,目的蛋白被诱导表达并收集纯化。重组蛋白与致敏DC、DC、Sap2蛋白均能有效延长系统性白假丝酵母菌感染小鼠生存期、保护小鼠肾脏、增强小鼠的免疫力,其中多组分联合免疫效果更佳。结论多组分联合免疫能很好地抵抗系统性白假丝酵母菌感染,这为研究新型多组分联合疫苗奠定基础。

不同状态下白念珠菌SAP2、MRR2与伊曲康唑耐药的关系

目的初步明确在浮游状态和生物膜状态下白念珠菌毒力因子SAP2和转录因子MRR2对伊曲康唑(ITR)耐药的影响。方法对10株伊曲康唑单耐菌株、10株氟康唑(FCA)/ITR/伏立康唑(VRC)全敏感菌株进行SAP2、MRR2基因测序,分析其基因突变对耐药的影响;通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察不同时段下白念珠菌生物膜的形成,并通过酶标仪测定其OD值判断生物膜形成能力与耐药的关系。RT-PCR分别对浮游状态及生物膜状态下临床分离白念珠菌进行SAP2及MRR2表达量的检测,研究二者表达水平与伊曲康唑耐药的关系,并对浮游及生物膜状态下MRR2Δ/Δ菌株SAP2表达量进行检测,进一步明确MRR2与SAP2的关系。结果通过基因测序发现,SAP2基因无错义突变,MRR2基因测序出现12个错义突变位点;通过RT-PCR发现在不同状态下,耐药菌株组SAP2[浮游/生物膜:(1.30±0.39)/(4.29±1.76)]和MRR2[浮游/生物膜:(0.95±0.14)/(1.77±0.80)]基因的表达量均高于敏感菌株组[SAP2浮游/生物膜:(0.80±0.48)/(2.59±0.93);MRR2浮游/生物膜:(0.49±0.32)/(0.98±0.64),P<0.05],在生物膜状态下两基因的表达水平SAP2(3.44±1.63)和MRR2(1.19±0.99)相比浮游状态下[SAP2/MRR2:(1.05±0.50)/(0.81±0.62)]均上调(P<0.05),且在浮游状态下,两基因之间有正相关关系(r=0.66,P<0.05),在浮游及生物膜状态下MRR2Δ/Δ菌株SAP2的表达[浮游/生物膜:(0.80±0.06)/(2.15±0.23)]相对于标准菌株ATCC11006[浮游/生物膜:(1.14±0.07)/(2.90±0.10)]均明显下调(P<0.05);通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察生物膜形成过程发现,所有菌株均形成了菌丝及孢子相互交错的生物膜,并通过测定其OD值发现,耐药菌株组生物膜形成能力(0.24±0.02)明显高于敏感组(0.15±0.02,P<0.001),MRR2Δ/Δ菌株的生物膜形成能力(0.12±0.12)明显低于标准菌株组(0.16±0.00,P<0.001)。结论伊曲康唑耐药可能与白念珠菌MRR2基因突变有关;在浮游状态和生物膜状态下SAP2和MRR2的高表达都可影响白念珠菌对伊曲康唑的耐药,MRR2高表达对SAP2可能存在正向调控关系,从而影响其耐药。

不同状态下SAP2和STP1在白念珠菌伊曲康唑耐药中的作用

目的探讨游离状态和生物膜状态下,毒力因子SAP2、转录因子STP1在临床分离白念珠菌伊曲康唑(ITR)耐药中的作用及其相互关系。方法实验菌株为临床分离伊曲康唑耐药白念珠菌菌株和敏感菌株各10株。首先,采用PCR方法对游离状态下临床分离白念珠菌伊曲康唑耐药和敏感菌株的SAP2、STP1进行测序,分析基因突变与耐药的关系;之后,利用96孔板构建白念珠菌生物膜;采用RT-PCR方法检测游离状态和生物膜状态下白念珠菌SAP2、STP1、STP1Δ/Δ的mRNA表达水平,比较分析不同状态下SAP2、STP1、STP1Δ/Δ的表达是否具有差异和相关性;进一步通过结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜观察白念珠菌生物膜在各时间点的生长形态以及SAP2、STP1、STP1Δ/Δ对其形成能力的影响。结果SAP2测序显示无错义突变,存在3个同义突变(T276A、G543A和A675C);STP1基因测序发现两个错义突变N394S和D71I,以及2个同义突变C453T、A799G,其中N394S在全部耐药和敏感菌株中都存在,而D71I仅存在于两株敏感菌株中。与敏感菌株相比,白念珠菌耐药菌株和STP1基因缺陷菌株(STP1Δ/Δ)的生物膜形成能力更强;耐药菌株在游离状态和生物膜状态下SAP2和STP1的表达均上调(P<0.05),并且与游离状态相比,耐药菌株和敏感菌株在生物膜状态下二者的表达量均显著升高(P<0.05)。而无论在何种状态下,SAP2和STP1的mRNA表达水平均呈显著正相关。此外,与标准菌株ATCC11006相比,STP1基因缺陷菌株(STP1Δ/Δ)中的SAP2表达在两种状态下也显著上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论生物膜的形成可以使白念珠菌伊曲康唑耐药性增加,但SAP2、STP1基因突变可能与其耐药性无关;游离状态下,SAP2的高表达与白念珠菌ITR的耐药性有关,而无论在游离状态还是生物膜状态下,白念珠菌对ITR的耐药性增加均与STP1有关。此外,STP1对SAP2是具有调控作用的,其机制亟待研究。

大跨、高层结构动力弹塑性和倒塌分析(Ⅲ):SAP2MARC和MARCPOST程序开发与应用

本文开发并实现了将有限元模型由SAP2000软件导入MSC.MARC软件中的接口程序SAP2MARC和MSC.MARC软件的可视化后处理程序MARCPOST。采用MSC.MARC子程序和UMAT程序所生成的材料数据,对某200m结构进行了大震作用下考虑应变率效应的动力弹塑性计算,并结合MARCPOST程序对结果进行提取和分析,可转换多种结构单元。

mp65和sap2真核表达质粒对小鼠系统性白色念珠菌感染的免疫保护作用

目的研究白色念珠菌mp65和sap2基因真核表达质粒对小鼠系统性白色念珠菌感染的免疫保护作用。方法将pcDNA3.1-mp65和pcDNA3.1-sap2质粒分别或联合免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠外周血中抗MP65和抗Sap2蛋白特异性IgG抗体,流式细胞仪检测免疫小鼠脾脏中CD4+、CD8+T淋巴细胞百分含量的变化,并观察白色念珠菌攻击后免疫小鼠的存活率。结果免疫后小鼠血清中可检测出抗两种蛋白的特异性IgG抗体,两种质粒均能诱导脾脏中CD4+T淋巴细胞百分含量增高,并可提高白色念珠菌系统性感染小鼠的存活率。结论pcDNA3.1-mp65和pcDNA3.1-sap2质粒均能诱导小鼠的体液免疫和以CD4+T淋巴细胞为主的细胞免疫,且对白色念珠菌的系统性感染有一定的保护作用。

Sap2在白念珠菌致病机制中的作用

Sap2是白念珠菌感染宿主后在天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartyl proteinase, Saps)家族中表达最强的酶,受多个系统的共同调控,包括环境中的氮源、氨基酸浓度、自身调节、Ecm33蛋白、OPI1因子和其他菌属微生物。白念珠菌可通过Sap2的多种特性(炎性体的激活、抗菌肽的分解、激肽的释放、补体系统的抑制和中性粒细胞的诱导迁移)发挥其黏附和侵袭功能,因此认为Sap2是白念珠菌感染宿主后主要的致病因子。现就Sap2的研究现状进行总结,旨在进一步了解Sap2在白念珠菌中的表达调控和致病机制,从而为抗真菌药物的研发提供新思路。

白色念珠菌sap2基因真核表达质粒的构建及免疫原性研究

目的构建以白色念珠菌SAP2蛋白编码基因sap2为目的基因的真核重组表达质粒,并对其免疫原性进行分析。方法RT-PCR法自白色念珠菌标准菌株ATCC64550中获取sap2基因,插入真核表达载体pcDNA3.1中,将真核表达经质粒大抽提并定量后免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体产生水平,流式细胞仪检测细胞免疫。结果RT-PCR法克隆出全长为1 197 bp的sap2基因;用构建的pcDNA3.1-SAP2免疫小鼠,能诱导产生效价为1∶1 600的IgG抗体,同时CD4+T和CD8+T细胞百分比增高。结论成功获取了白色念珠菌sap2蛋白基因,真核表达质粒能够诱导动物的体液免疫和细胞免疫。

新型三嗪类白念珠菌SAP2抑制剂的设计、合成和生物活性研究

近年来,侵袭性真菌感染的发病率和死亡率不断上升,迫切需要研发具有新型作用模式的抗真菌药物。靶向毒力因子是一种新的抗真菌药物发现策略。分泌型天冬氨酸蛋白酶2(SAP2)是一种毒力因子,是一种新兴的抗真菌靶点。然而,发现小分子SAP2抑制剂仍然是一个重大的挑战。本研究从前期筛选得到的三嗪类小分子SAP2抑制剂A12入手,经合理设计和结构优化后,化合物的SAP2抑制活性显著提高,并对其构效关系进行总结。其中化合物8a和8c在白念珠菌感染的体内模型中表现出良好的抗真菌活性。并且,该类化合物(8a和8b)对于真菌生物被膜具有较好的抑制作用。因此,三嗪类小分子SAP2抑制剂是一类具有研究前景的新型抗真菌先导化合物。

多点地震下大跨展览馆动力弹塑性分析

为研究大跨空间展览馆在多点地震激励下的弹塑性反应和抗震性能,利用SAP2000软件建立结构的有限元模型,采用TJU.SAP2ABAQUS接口程序转化为相应的ABAQUS模型,经模态分析验证了转化前后模型的一致性.分别考虑单向和三向地震输入,对该结构进行了地震一致和多点激励下的动力弹塑性分析.结果表明:单向多点地震激励下,柱底内力、剪力墙应力以及结构顶部位移均较一致激励时增大;三向多点激励下,结构柱底内力和剪力墙的应力较单向多点激励时有增有减,结构顶部位移增大;多点激励对结构两侧柱底内力的影响显著,对中部柱底内力的影响较小.

基于ABAQUS的超高层建筑动力弹塑性抗震分析

某国际金融中心超高层建筑共113层,结构高度423m。首先,利用SAP2000软件建立结构的有限元模型,通过基于C#语言开发的导航式接口程序TJU.SAP2ABAQUS将SAP2000模型转换为ABAQUS模型。然后,依据规范进行7°多遇、基本和罕遇地震作用下的弹塑性时程分析。最后,模拟了超大震作用下该超高层结构的破坏过程。结果表明,(1)不同强度地震作用下结构的层间位移角均能满足规范限值要求。(2)罕遇地震作用下,结构满足大震不倒的抗震设防要求且有较高的安全储备。(3)超大震作用下,结构竖向刚度变化位置是结构潜在的薄弱部位,在抗震设计时应给予重点关注。

白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶重组蛋白的表达及纯化

以白色念珠菌为实验材料,利用玻璃珠破碎法、PCR技术克隆白色念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因,根据基因重组技术构建Sap2原核表达载体,使之表达蛋白并且将目的蛋白纯化.将获得的Sap2蛋白免疫兔子,进行Western blot分析,研究了白色念珠菌天冬酰胺蛋白酶的免疫学原性.

醋酸锌与水杨醛缩邻氨基苯酚的固相反应研究

醋酸锌与水杨醛缩邻氨基苯酚的固相反应研究傅岩韩振茂（南京铁道医学院化学教研室南京２１０００９）林建军（浙江师范大学化学系金华３２１００４）长期以来，人们对于化学反应的认识一直局限于气、液相反应和高温下的固相反应，而室温下的固相反应则被认为是根本不可能...

含有SAP结构域的肌肉增强因子2激活基因对肝细胞癌细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制

目的探讨含有SAP结构域的肌肉增强因子2激活基因(MAMSTR)对肝细胞癌(HCC)预后的影响,以及对HCC细胞增殖和凋亡的作用和可能机制。方法从TCGA数据库中获取369例HCC患者肿瘤组织和正常肝组织mRNA数据和相应临床信息。通过Wilcoxon检验分析MAMSTR基因在HCC组织和正常肝组织中的表达差异。通过Kaplan-Meier曲线和Cox回归模型分析MAMSTR与HCC患者预后的关系。应用基因功能富集分析(GSEA)检测MAMSTR在HCC中的潜在生物学功能。使用慢病毒包装质粒构建可诱导表达MAMSTR siRNA的HepG2肝癌细胞系。通过细胞计数、克隆形成和Caspase 3活性实验检测体外条件下MAMSTR对HCC细胞生长和凋亡的作用。使用蛋白质印迹、定量PCR实验分析MAMSTR影响HCC细胞凋亡的分子机制。通过转录因子分析MAMSTR对HCC生物学功能调控的可能信号通路。结果与正常肝组织比较,MAMSTR基因在HCC组织中高表达,P<0.001;且其表达量与年龄和临床分期有关联,均P<0.05。生存分析显示,高表达MAMSTR组患者中位生存期较短,χ^(2)=14.257,P<0.001。单因素(HR=1.302,95%CI为1.160~1.461)和多因素Cox回归模型(HR=1.265,95%CI为1.124~1.424)表明,MAMSTR可以作为HCC患者预后的独立危险因子,均P<0.001。单样本基因集富集分析(ssGSEA)分析发现,MAMSTR高表达组中CD56dim自然杀伤细胞(W=536,P=0.018)、效应记忆CD8+T细胞(W=576,P=0.048)、嗜酸性粒细胞(W=305,P<0.001)、1型辅助性调节T细胞(W=497,P=0.006)和17型辅助性调节T细胞(W=439,P<0.001)抗肿瘤免疫细胞出现下调。同时,促肿瘤免疫细胞记忆B细胞(W=1010,P=0.022)和2型辅助性调节T细胞(W=1191,P<0.001)上调。GSEA结果显示,MAMSTR可能调控E2F转录因子[标准化富集分数(NES)=2.475,P<0.001]、PI3K/Akt/mTOR(NES=1.438,P=0.002)等信号通路。定量PCR检测发现,敲低组细胞MAMSTR的相对表达量(0.624±0.006)明显低于对照组(1.000±0.010),差异有统计学意义,t=45.998,P<0.001。生长计数和克隆形成实验发现,敲低MAMSTR表达可以抑制HepG2细胞生长,t=11.372,P=0.008。Caspase 3活性实验结果显示,Dox(+)组细胞中Caspase 3相对活性(2.209±0.027)明显高于Dox(-)组(1.000±0.017),差异有统计学意义,t=66.576,P<0.001。蛋白质印迹实验验证了在敲低MAMSTR表达的HepG2细胞中,PUMA蛋白在Dox(+)组(1.390±0.018)中相对于Dox(-)组(0.988±0.030)表达上调,差异有统计学意义,t=16.270,P=0.004;BCL2蛋白在Dox(+)组(0.565±0.005)相比Dox(-)组(1.046±0.038)表达下调,差异有统计学意义,t=17.635,P=0.003。定量PCR实验显示,BAX基因在Dox(+)组中相对表达量(1.415±0.055)明显高于Dox(-)组(1.000±0.020),差异有统计学意义,t=9.969,P=0.010。转录因子分析表明,MAMSTR可能通过E2F1参与调控细胞生长,相关E2F1蛋白转录结合域包括cisbp_M3134、transfac_pro_M00920和transfac_public_M00516等。进一步分析发现,E2F1与MAMSTR表达呈正相关,r=0.566,P<0.001。结论MAMSTR基因是促进HCC进展和导致HCC患者预后不良的可能因素之一,其可能通过调节E2F1转录因子网络进而调控HCC细胞增殖和凋亡。